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(無題) 削除/引用 No.12812-7 - 2025/02/04 (火) 13:36:55 - Liar 競合法でバックグラウンドの補正をかける場合は、「まったく何も入れない」とか「標識抗原のみを入れた」ウェルの値を用います。 これがnon-specific bindingと呼ばれるもので、この値は最も低くなります。 ELさんのおっしゃるOD値が最も高くなるウェルは、おそらくtotal bindingのことで、B0とも表現されるところです。 競争相手がいないので、くっつくべきところすべてに標識抗原が結合している状態とお考え下さい。 競合法はB0のOD値に対する標準物質 or サンプルのOD値の割合で計算することができます。

(無題) 削除/引用 No.12812-6 - 2025/02/04 (火) 10:19:11 - おお ＞競合法ELISAだとblankの吸光度が一番高いので引き算ができません。 その高い値からの差をみて濃度を決めていると言えるのでは。ですからちゃんとリファレンスになっているはずです。

(無題) 削除/引用 No.12812-5 - 2025/02/01 (土) 19:26:16 - あの もうちょっと、念のために補足しておきます。 サンドイッチ法でも、濃度ゼロのウェルはブランクではありません。この点を勘違いしているかもしれませんね。 ブランクのウェルは、非特異的な結合量を調べるものです。そのため、第二抗体も第一抗体も一切がウェル内に存在しない状態でのOD値がブランク値です。別名は、次です 　non-specific binding あるいは 　normal serum background Normal IgG background それから、もしかしたら第一抗体や第二抗体の意味も勘違いしているかもしれませんね。 抗原に直接結合する抗体が第一抗体で、第一抗体に結合する抗体が第二抗体です。 決して、アッセイのプロトコルでウェルに入れる順番ではありません。

(無題) 削除/引用 No.12812-4 - 2025/02/01 (土) 17:15:58 - あの なかなか、簡単に説明するのは難しいのですが、 一言で言うと、競合法では濃度ゼロは、一つのスタンダードであって、ブランクではないのです。通常は、一番、OD値は、全ての濃度スタンダードの中では、一番高くなります。 ですから、もし濃度ゼロのOD値を、他の濃度スタンダードのODから引き算すると、全部マイナスの値になってしまいます。とてもおかしなことになりますよね。 そのため、サンドイッチ法のための濃度計算アルゴリズムと、競合法のものは異なるのです。 くれぐれも、濃度ゼロのウェル無しで測定しないことです。 市販のキットには、ブランクを測定できるウェルの設定は無いです。 以下は、当方による貴方の環境について推測していますので、間違えているかもしれないので、読み流してください。4パラメーターということから、もしかしたら、バイオラッドのプレートリーダーに付属のソフトを使っているかもしれません。あのソフトは、かなり特殊で、ユーザーが特に設定しなくても、サンドイッチ法も競合法も計算してくれます。そのため初心者ユーザーは混乱するだろうなと思います。 以上の説明で、なんとなくでもわかった感じになれなければ、残念ながら当方には説明は不能です。イムノアッセイの成書を読んで勉強してください。

(無題) 削除/引用 No.12812-3 - 2025/02/01 (土) 16:24:14 - EL ありがとうございます。 何度も読み返しているのですが理解が追い付かず、再度お聞きします。 ＞結論からいうと、濃度ゼロは絶対に測定すべきです。 ＞簡単にいうと、競合法のEIAでは、非特異な結合量(貴方の思うBlank)測定は省略することが多いです。ラジオイムノアッセイならば測定しますが。 絶対に測定すべきだけど、省略することが多い。 得られた数値からどういう情報を取るために測定するものですか？ ＞もし競合法のEIAでも、非得意的な結合量を測定したいなら、マイクロプレートに第二抗体も第一抗体もない状態のウェルを設けておく必要があります。これは自作のアッセイなら、やろうと思えばできます。 ＞しかし高価な販売品には、そのようなウェルなんて設定しないのです。 確かにkitには1次抗体や2次抗体入れないwellの指示はないのですが、0濃度のassay bufferのみを入れるwellは入れるようにいくつかの競合法ELISAの取説には書いてありました。通常のELISA kitの取説にはblank引きして4paraで検量線を書かせなさい…等の指示があることが多いのですが、競合法は見つけた限りではstd調製法には0が入っているのに解析法では触れられていません。 特に指示なく検量線例のデータとしてODと濃度のグラフが載っているだけです（両対数なので、0は使っていない？）。 すでに測定して、stdのなかで一番高い数値が出ているところまでは出ています。 このままstdの最低濃度より高い数値だなーと眺めて計算等には使わずにしれっと無視してほかの数値だけで解析をするのでいいのでしょうか。 理解力がなくてすみません。

(無題) 削除/引用 No.12812-2 - 2025/01/31 (金) 02:51:40 - あの 競合法とサンドイッチ法の測定法や計算方法の違いを、根本的に勘違いしています。 競合法はスタンダードカーブは右下がりで、サンドイッチ法は右上がりですよね。 結論からいうと、濃度ゼロは絶対に測定すべきです。 簡単にいうと、競合法のEIAでは、非特異な結合量(貴方の思うBlank)測定は省略することが多いです。ラジオイムノアッセイならば測定しますが。 もし競合法のEIAでも、非得意的な結合量を測定したいなら、マイクロプレートに第二抗体も第一抗体もない状態のウェルを設けておく必要があります。これは自作のアッセイなら、やろうと思えばできます。 しかし高価な販売品には、そのようなウェルなんて設定しないのです。 もし数学が苦手で、アルゴリズムを知らずに、なんらかのソフトを使って計算する必要があるならば、簡単な対策は次です: 　Blankの値にはゼロを入力

競合法ELISAのBlankの扱いについて 削除/引用 No.12812-1 - 2025/01/31 (金) 00:26:17 - EL 濃度を測定したい項目があり、競合法ELISAのkitを使うことになりました。 通常のELISAでは検量線を作るときに0濃度(kitのAssay Buffer)のblankを入れておいて、すべてのwellの吸光度からblankの吸光度を引いて、検量線から濃度を算出しているのですが、競合法ELISAだとblankの吸光度が一番高いので引き算ができません。 blankの値はどのように扱ったらいいですか？ いくつかのkitの取説を見たのですが、解析方法に説明は見つけられませんでした。 いつもblankを使ってbackground補正をかけているのに、このkitの時だけ何らかのbackの補正をかけないのも変な気がします。 stdの0にBufferをのせることは書かれているのですが、引き算しないなら何のために測定しているのかなと思います。

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