全13件 ( 1 ～ 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12807-13 - 2025/02/05 (水) 18:30:32 - j 蛍光バージョンではWBで検証してなくても同じクローンでWBで使えてるものであれば、使えると思います。ていうか抗体の蛍光標識kitが最近は安価で販売されているので、自分で手持ちの抗体に標識すればどうでしょうか。うちらはそうしてます。

(無題) 削除/引用 No.12807-12 - 2025/01/30 (木) 08:14:43 - TS >ちなみにポンソー（あるいはCBBでも）で染色したあと、どのように画像を得ます 普通のスキャナですね。Epsonのを使っています。透明なフィルムみたいのに破産でスキャンです。

(無題) 削除/引用 No.12807-11 - 2025/01/30 (木) 05:02:58 - おお >western用ではそのような抗体はありませんでした。 確かにWBで使えるとかいている蛍光色素がついた抗体がアクチンにはないのだけど、WBでつかえるモノクローナルクローンを使ってますからねぇ、、、使えると思えるんですけどね。自社でWBの検証をしてないだけなんでしょうかねぇ。それともライセンスや特許的なものでWBの用途をうたえないのか、、、蛍光色素でWBの検出を全面に出しているのはLI-CORとバイオ・ラッドでしょうけど。 モノクロでWBで使っているクローンであればまず使えると見て、各社探してみてサンプルや少容量（トライアル）で販売しているところなど試してみてはどうでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.12807-10 - 2025/01/30 (木) 04:16:23 - おお >[Re:9] Eさんは書きました : > > ポンソーはどうー > > > 染色は、PonceauSです。 > > ちなみにポンソー（あるいはCBBでも）で染色したあと、どのように画像を得ますか？専用のスキャナー？普通のコピーできるスキャンでしますか？あるいはデジカメで撮る？ GelやWBのイメージングでつかうImagerに明視野の撮影モードがありますのでそれを使ってます。 コピー機などでのスキャンやデジカメ（携帯）での撮影でも特に問題はないと思います。ただデジカメなどで取る場合は膜にあたっている光の角度などでうまく取れないことがあります。昔からよくある（カメラ使われた）手法では暗室などで左右斜めから照らして反射光がカメラに入らないようにして撮影するというものがありますが、暗室がある研究施設だったら残っているかもしれません。 そこまでしなくても直接蛍光灯（など）からの光が刺さないような環境を作れば遜色ない画像がとれます。例えばケミカルフードのなかでフードない明かりを点灯せずにやるとか。ラボの環境、構造等によるのでより良い場所はそれぞれだと思いますので自身で探してみるしかないでしょう。 デジカメや携帯にしても一昔前にやったことがありますが、接写が結構難しくピンボケや手ブレが目立つことがあって三脚みたいなので固定してタイマー機能を使おうとしたら三脚が徐々に傾いてなんじゃこれみたいなことがありましたが、今の性能的にはどうなんでしょうかね。あと被写体（膜）の面と並行にしないときれいに取れないというのもあります。接写ではちょっと傾いただけで左端はきれいに取れていて、右端はピンボケとかも。かなり微調整が必要だったことを思い出します。 ちなみに私はPonceauSの代わりにFast greenを使ってます。PonceauSよりタンパク質への吸着が安定していて（水で洗っている）かといってTBSTなどで洗えばそんなにじゃまになることなくきれいに取り除けます。Fast greenでよく出回っているレシピは確か酢酸かメタノールの量が多くPVDFむけですが、PonceauS用のレシピで色素だけFast greenにしてNC膜でも使えるようにしています。

(無題) 削除/引用 No.12807-9 - 2025/01/30 (木) 01:08:45 - E > ポンソーはどうー > 染色は、PonceauSです。 ちなみにポンソー（あるいはCBBでも）で染色したあと、どのように画像を得ますか？専用のスキャナー？普通のコピーできるスキャンでしますか？あるいはデジカメで撮る？

(無題) 削除/引用 No.12807-8 - 2025/01/29 (水) 18:19:55 - ぽんそー ポンソーはどうー

(無題) 削除/引用 No.12807-7 - 2025/01/29 (水) 15:15:56 - 234 本議論の内容についてはATTO社の『 Total proteinによるノーマライズの方法』というサイトが有用と思われますので一度参照されることを勧めます。

(無題) 削除/引用 No.12807-6 - 2025/01/29 (水) 14:29:57 - TS >転写後のブロッキング前に次を用いて、総タンパクを測定しています うちも専らこれですね。染色は、PonceauSです。コストはほぼタダで良いですよ。 Stain freeとかの専用？試薬よりは精度は若干劣るようですが、実質的に困ったことはないです。蛍光検出の邪魔をしないかどうかは確認してもらった方が良いかもです。 Anal Biochem. 2022 Oct 1:654:114840. doi: 10.1016/j.ab.2022.114840.

(無題) 削除/引用 No.12807-5 - 2025/01/29 (水) 14:00:06 - 234 昔から, blockingしたメンブレンを検出まで一通り終わってから、いつもCBB染色していますがタンパク質バンドのみ鮮明に染まり（ゲル染色では見えなかった薄い細いバンドがはっきり見えたりします）、back groundはほぼ全く染まらず、せいぜいごく薄い青か、脱色を少し長めにすればまっ白になります。数時間放置すると乾燥しますので乾燥したらラップに包んでWBのデータと並べてノートにはってます。なので、メカニズムは分かりませんがBSAやskim milkなどのblockingのたんぱく質がback groundを上げるようなことはないようです。

(無題) 削除/引用 No.12807-4 - 2025/01/29 (水) 13:09:28 - あの 当方では、 　βアクチンとかGAPDHが内部コントロールとして使ってよいか未確立のサンプルや、使ってはいけないという考え方が主流（脳）のサンプルの場合には、 転写後のブロッキング前に次を用いて、総タンパクを測定しています： 　REVERT 700 総タンパク質染色液 （100 mL）926-11011　㈱スクラム 　　https://www.licor.com/bio/reagents/revert-700-total-protein-stain 脱色液（酸とアルコール）は自作できますが、脱色したらすぐに中性のバッファで洗った方がよいです。 βアクチンとかGAPDHを使ってもよいなら、既にもっている第一抗体と、機器設備上で都合のよい第二抗体を適当に選んで買えばよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12807-3 - 2025/01/29 (水) 12:37:24 - kan blocking後の場合、BSAやスキムミルクがメンブレンに残留しloadしたタンパクのみ染めてみることが難しいのでは、と懸念してしまいますがその点問題無いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12807-2 - 2025/01/28 (火) 13:10:07 - 234 western blottingで検出したあとmembraneをCBB stainできます。蛍光より安価で簡単です。染色、脱色したmembraneを室温放置で自然乾燥したあとスキャナーに取り込んで画像をimage Jでレーン全体を囲んで定量できます。特定の内在性コントロールで補正する場合、予期せぬ内在性タンパク質の発現等の変動が起きると、そのまま補正したら結果の解釈を誤るリスクがありますが、この方法は主要タンパク質全体で補正するためそうしたリスクを回避できます。ビジュアル的にも同じ量ロードしてます的な説得力あります。 以前は内在性コントロールタンパク質で補正しないと受け入れてくれないレビュアーがたまにいましたが、ここ最近はそういうことを言う人もいません。 方法や試薬組成についてはいろいろなバリエーションがありますが、例えば http://www.protein.osaka-u.ac.jp/metabolism/PVDF.html

蛍光ウエスタンのローディングコントロールについて 削除/引用 No.12807-1 - 2025/01/27 (月) 19:33:25 - GAO お世話になります。 これまでHRPでの化学発光を使ったウエスタンをしてきましたが、目的のバンドを検出したのちに、直接蛍光標識ローディングコントロール抗体で補正用のウエスタンを続けて出来ればと思っています。 ケミルミにiBrightを使っていますが、蛍光も検出できるはずです。 そこでお手頃な抗体をご存じでしたら情報をシェアいただきたいです。 Biolegendはよくキャンペーンをしており、安いイメージですが、western用ではそのような抗体はありませんでした。 コメントいただけましたら幸いです。

全13件 ( 1 ～ 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---