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(無題) 削除/引用 No.12798-5 - 2025/01/22 (水) 13:51:28 - ゆなうな 皆さんありがとうございます。 基本的には問題なさそうで安心しました。 一度WBでサンプル間の比較をしたときに、濃度依存的にならず中間サンプルで発現が弱い、という結果となってしまい、ライセート中のもやが原因じゃないか（可溶化が不均一だったのではないか）と考えました。そうしてこのスレッドを立てるに至ります。 RIPAバッファーの組成は　20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0.1%SDS, 0.5% Sodium deoxycholate/pH7.5 でした。 細胞数は通常よりも多いので（以前にBCA測定した際濃度が低かったため細胞数を増やした）、それが原因でもやが見えているんだなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.12798-4 - 2025/01/22 (水) 08:23:47 - TS RIPAの組成はどんななのでしょうか。バリエーションがあるかなと思うのですが。ただ他の方もおっしゃっているように、熱変性とかしないで、完全に透明にならないのは不思議ではないです。 解決策としては、問題なければSDS濃度を0.3-％くらいに上げて、超音波の前か後に熱変性を入れれば、かなり透明になることは多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.12798-3 - 2025/01/22 (水) 02:23:46 - おお 白く濁るようなことがあるのだけど私はそれは脂質類で溶けにくいものが見えているのだと思います（きちんとプロトコール通りなら）。溶けにくい蛋白であれば遠心で底に来ることがたいていです。どう扱ったらいいかは実際に見てみないとなんとも言えないですが、均一に濁っているような状態ならそのまま使ってもいい場合は多いです。それでも気になるなら尿素を加えるなどもやり方ですが、尿素をいれるとかなり変性が促進されますし、熱を加えると修飾が起こりますから扱いに注意が必要になってきます。興味があれば少し詳しく書きますけど。

(無題) 削除/引用 No.12798-2 - 2025/01/21 (火) 19:46:13 - 独り言 タンパク質は可溶化できても、脂質膜、ゲノム、脂肪滴などを完全に溶解することは困難です。細胞数が多いとこれらの不溶性物質が白くみえます。 普通は、遠心して、可能化した上清を用いればいいはずですが、完全に溶解しないといけないような実験なのでしょうか。

ライセート調製について 削除/引用 No.12798-1 - 2025/01/21 (火) 17:33:48 - ゆなうな ウェスタンブロット用に細胞のライセートを調製しているのですが、溶液中に白いもやのようなものが観察されました。細胞片だと考えていますが、なかなか分解されません。 そういった経験がある方いらっしゃればどうやって解決したかご教授願いたいです。 今は細胞にRIPAバッファー添加後30分氷で静置後1分間ソニケーションしています。

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