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(無題) 削除/引用 No.12791-5 - 2025/01/19 (日) 03:45:52 - おお 因みに肝細胞は小胞などの膜系の細胞小器官が発達していて、デタージェントを入れずにタンパク質を抽出する必要があるとしたら、そう言う膜系に存在する酵素活性を見る時などの場合かと(p450の活性とか)。 で大学の生化学の授業とかで聞いた話で、そう言う抽出をしたサンプルを長期使用していると(凍結して保存して凍結融解を繰り返したのか、4度で保存したのかとか詳細は不明)、pHが徐々に下がってくると言う話｡リソソームなどが徐々に壊れるためという説明だった｡ で先のコメントで示した文献でEDTAが効かないDNase II はリソソームに発現している。

(無題) 削除/引用 No.12791-4 - 2025/01/18 (土) 11:16:13 - G25 一般的に組織からgenomic DNAを精製するときのhomoginize bufferにはもっと高濃度のEDTAが入っているものです。0.1 Mとか。 あたしのプロトコールだと TET: 0.1M tris-HCl/ 0.1M EDTA/ 0.5% Triton X-100, pH7.5 TES: 0.1M tris-HCl, pH8.0/ 0.1M EDTA/ 1% SDS など。 TETは核を粗抽出してからDNA精製するときに（核画分にしてからSDSやSarcosylを加える） TESはSDSでいきなり核まで壊してDNAを溶出させるとき。 ゲノムDNAを精製するときはDNA溶出から速やかに高濃度のEDAT、SDSなどの界面活性剤、場合によってProKを加えるものです。

(無題) 削除/引用 No.12791-3 - 2025/01/18 (土) 10:33:29 - おお https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7407206/ Table 1. >デタージェントは，この段階での溶出を防ぐためにいれていません。 よくわかりませんが、細胞は壊れてCytosolが溶出していてもおかしくはないと思いますが、、、 それよりもさいしょからSDSをいれてポリトロンでゲノムも裁断したほうがよろしくないですか。 指摘にありますようにヒトや動物の細胞のLysateを４度で放置は普通はよろしくないかと。

(無題) 削除/引用 No.12791-2 - 2025/01/18 (土) 09:11:25 - hぬ 細胞内の内在性のDNaseがある程度働いてDNAの切断が進むことはあるでしょうが、インヒビター入れてなくても４℃保存中に一晩でDNAが粘性がなくなるまで短くバラバラになることは私には考えにくいです。特に４℃でEDTA存在下ならば尚更。未変性状態で4℃で一晩置いた場合、むしろタンパク質は無視できないレベルでの分解が進むと思いますので（SDS存在下でも分解することはあるので）、もしタンパク質の分析を予定しているならばSDSなしで4℃で一晩置くのは、結果に良くない影響を与えることが懸念されます。ヌクレアーゼでもプロテアーゼでもフォスファターゼでも酵素活性が残存するような温和な条件で組織ライゼートを長時間置くのは、実験目的からそうしなくてはならない必要性が特にないならば、極力避けた方が良いと思います。 あと、SDSは低温では溶解度が低く析出したりします。単に十分に溶けていないだけではないでしょうか。もしくは、これは可能性は低いですが、使用してる試薬のいずれかに多量のDNaseがコンタミしてるとか。以前にDNaseを使用した実験をしたとか記憶ありますか。

DNases？ 削除/引用 No.12791-1 - 2025/01/18 (土) 04:54:05 - LPS 肝臓のライゼートをポリトロンを用いて作成しています。 組織のホモジナイゼーションには、リン酸緩衝液に、複数のプロテアーゼインヒビターと５ｍM　EDTAがはいっています。デタージェントは，この段階での溶出を防ぐためにいれていません。 この組織懸濁液に、破砕後、ただちにSDSを４％で加えると、懸濁液は直ちに粘張な様相を呈します。これは、ｇDNAの為だと理解しているのですが、この懸濁液をSDSを加えないで、４Cで一晩放置後、同様にSDSを４％の濃度で加えても粘張にならないのです。 懸濁液には５ｍMのEDTAが入っているのですが、これは組織中のDNasesを止めるのには十分ではないということなんでしょうか？

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