全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12788-8 - 2025/01/18 (土) 17:03:00 - Vec 発現ベクターを導入した細胞は目的遺伝子を発現していない神経の幹細胞です。 どうもこの遺伝子にはプロテアソーム分解を受けるユビキチン化部位が存在していることがわかりました。 もしかしたら細胞内で強く分解されているかもしれないので、MG132などを使うとWBで検出できるようになるか調べてみようと思います。 また何かわかれば書き込みます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12788-7 - 2025/01/18 (土) 09:39:54 - 独り言 １，CAGプロモーターは後ろ側にglobin intronがありますが、インサートがイントロンのなかに食い込んでいる？ラボ内で、同じベクターを使って、ほぼ同じ位置んに遺伝子を入れて発現した実績はありますか？ ２，なぜかわからないが、単独の過剰発現では凝集体を作り分解される。発現チェックにlysis bufferで溶解して遠心後上清をWBしているのですか？その場合は、凝集体はペレットにいくのでのぞかれている場合があります。細胞すべてをそのままsample bufferでボイルしてWBすると見えるかもしれません。またはMG132などプロテアソームインヒビターで細胞を処理して、WBしてみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12788-6 - 2025/01/18 (土) 01:13:03 - おお 血球系の細胞はCMV系のプロモーターはイマイチだという話もありますね。CAGもベースはCMVですし。EF1とか使う人もまあまあいる。 蛋白の性質として分解しやすいものもありますね。私が扱っていた蛋白で発現ベクターを導入してもほとんど発現しないものがあって、どうしたもんかとおもいながらユビキチンがつくばしょで網羅的解析で比較的頻度が高そうでなおかつ機能的なアサインメントがない部分をRに変えたらよく発現するようになったということがあります。 何が原因なのか探っていく必要がありそうです。 お使いの細胞はその遺伝子を発現してないのですか。

(無題) 削除/引用 No.12788-5 - 2025/01/17 (金) 19:16:11 - Vec AAさま、ありがとうございます cDNAは800bpほどしかなく、ベクターのサイズは5Kbpほどです。 細胞に導入してもアポトーシスを起こしてる感じは全くないです。 EGFPを挿入するなどの方法も検討しないといけんですね！

(無題) 削除/引用 No.12788-4 - 2025/01/17 (金) 12:44:18 - AA 細胞死を誘導するなど、目的の発現ベクターが導入された細胞が選択的に淘汰されるような事があると、遺伝子導入がうまく行っていてもあとでWBするときにはみられないということもあるかもしれません。 ベクターを、CAG-目的分子CDS-2A-EGFP、というような発現カセットにしたら顕微鏡下で導入された細胞が確認できるので、EGFPオンリーと比べて極端に陽性細胞数がへるのであればそういう事かもしれません。 あるいは単に目的分子がでっかくて、それに応じてプラスミドもでっかくなってるから導入効率が低い、とか。

(無題) 削除/引用 No.12788-3 - 2025/01/17 (金) 12:31:15 - Vec おおさま 早速のアドバイスをありがとうございます！ ランダムプライマーでも良いということで、安心しました。 CDSはシーケンスで確認しており、mutationは入っていませんでした。 ちなみに作製した発現ベクターは、 CAG promoter - kozak(GCCACC) - atgから始まりtagで終わるCDS - SV40 polyA (発現ベクターのもの)となってます。 発現ベクターに問題がなければ他の原因を探るのですが(promoterが細胞に相応しくない等)・・・。

(無題) 削除/引用 No.12788-2 - 2025/01/17 (金) 12:13:05 - おお >cDNAライブラリーはランダムプライマーを使って逆転写したものでした。オリゴdTプライマーで逆転写した方がよかったのでしょうか？ coding sequence (CDS) がはいっていたらランダムプライマーであろうとオリゴdTプライマーであろうと関係ないですよ。インサートはシーケンスしました？

発現ベクターの作製方法について 削除/引用 No.12788-1 - 2025/01/17 (金) 11:41:34 - Vec ある遺伝子のcDNAをcDNAライブラリーからPCRで増幅させて、CAG promoterの発現ベクターに挿入しました。 これを細胞にエレポで入れた後でWBをしてみたのですが、全くバンドが検出されませんでした。 細胞へのエレポはEGFP発現ベクターで発現を確認したことがあり、WBの抗体もワークすることは確認してます。 ちょっと気になったのですが、cDNAライブラリーはランダムプライマーを使って逆転写したものでした。 オリゴdTプライマーで逆転写した方がよかったのでしょうか？ 発現ベクターはcDNAのATGの前にコザック配列を入れており、マルチクローニングサイトのすぐ後ろにSV40ポリAが入っています。 初歩的な質問で申し訳ございません。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---