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(無題) 削除/引用 No.12781-16 - 2025/01/15 (水) 06:11:58 - おお https://www.nature.com/articles/s41598-018-36963-3 この文献ではMetのIFのシグナルは総じてリガンドなどの刺激で強くなってますが、WBではそんなに変化がないですね。両者の定量性に関してはどこまで厳密にやっているかわかりませんけど。

(無題) 削除/引用 No.12781-15 - 2025/01/15 (水) 05:35:10 - おお IFのばあい抗原の構造や周りの環境（複合体を作るとか）でも抗体のaccessibilityが変わるでしょうからそういうのも考慮しないと行けないかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.12781-14 - 2025/01/15 (水) 02:35:02 - mont あり得ない、とは言えないでしょうが、簡単には信じ難い結果です。 私自身にそのような経験はありませんし、見聞きした覚えもないです。 面白いというより、私ならIFやWBのどちらかの結果が信用できないのではないか？と不安になります。世に出ている抗体、KOで検証しない限り（ギリKD使用)、ただのノンスペかもしれません。IFって、ちゃんとしたコントロールがないと、レーザー強度や感度を上げると、自家蛍光だけで、それらしい像が見えてしまいます。 抗体の特異性（これが一番大事）、ある処理による自家蛍光の変化、局在の変化など、いろんな可能性を否定できる、あるいは肯定できる確かなコントロールをもって、科学的に理由を考えるしかないと思います。

(無題) 削除/引用 No.12781-13 - 2025/01/15 (水) 02:28:23 - おお >[Re:12] 交代さんは書きました : > 濃度によってはというのは、2価で結合できるほど抗原が密になれば、というつもりです。 ELISAではそれは起きないということですか？ 2価で結合できるー＞蛋白分子あたりの抗体量がへるー＞シグナルが目減りする。 2価で結合できるー＞抗体のアフィニティーが高くなるー＞シグナルが強くなる。（そこまで抗体の結合能力が低いのか？） いろんなことが考えられますが理論的にどうなるんでしょうね。ちょっと生化学的な解析を探したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12781-12 - 2025/01/14 (火) 13:59:48 - 交代 濃度によってはというのは、2価で結合できるほど抗原が密になれば、というつもりです。

(無題) 削除/引用 No.12781-11 - 2025/01/14 (火) 11:54:54 - 独り言 それと、IFの場合は、抗体のノンスぺの可能性がある。 KO細胞でシグナルが見えなくなるような、よい抗体であれば問題ないけど、モノによっては目的タンパク質よりも、ノンスぺのほうがシグナルが強くなることはよくあるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12781-10 - 2025/01/14 (火) 11:11:07 - おお ９６Wellのそこに抗原を貼り付けますから、面積当たりの抗原量を測っているイメージなのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.12781-9 - 2025/01/14 (火) 10:37:06 - 交代 「面積あたりの抗原の濃度によって」はです。 >[Re:8] おおさんは書きました : > > ELISAは直線性があるものが大抵ですが。

(無題) 削除/引用 No.12781-8 - 2025/01/14 (火) 01:04:33 - おお >[Re:7] 交代さんは書きました : > 抗体って2価だから、シグナルは面積あたりの抗原の濃度によってリニアじゃなくなるでしょうね。 ELISAは直線性があるものが大抵ですが。

(無題) 削除/引用 No.12781-7 - 2025/01/13 (月) 22:50:24 - 交代 抗体って2価だから、シグナルは面積あたりの抗原の濃度によってリニアじゃなくなるでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.12781-6 - 2025/01/13 (月) 21:28:17 - TS 違うタンパクを検出してるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12781-5 - 2025/01/12 (日) 17:35:38 - 独り言 普通に考えたらないでしょう。 IFの染色が、細胞内全体に抗体が振盪してないとか、局在の変化で強く見えるとかあるかもしれないし、、染色時の細胞数が極端に違うと染色効率も変化する。 WBも核内と細胞質でLysis bufferの抽出効率が変わるし、膜への強い結合が変化するとかでも変わるかもしれない。 量的な変化は、基本的にはWBのほうが定量的であり、IFで定量することはより厳密に実験しないといけない。 つまり、WBで変化しないものを、IFの結果だけから変化するというのは、なにかを見落としているのでは。

(無題) 削除/引用 No.12781-4 - 2025/01/12 (日) 14:05:16 - 774R 「ある処理」をしないと蛍光タンパク質が酸性のコンパートメントに存在していて、蛍光が弱まってた可能性。

(無題) 削除/引用 No.12781-3 - 2025/01/12 (日) 13:35:27 - み 処理によって細胞膜への集積率（局在化）が増加したのかも。 再現性をみないとですね。

(無題) 削除/引用 No.12781-2 - 2025/01/12 (日) 11:48:31 - おお 同じタンパク量でも一箇所に集まってくると輝度は強くなるでしょうし、より分散していると弱く見えるでしょう。 一つの可能性として。

IFとWBで結果が違うとかあるでしょうか 削除/引用 No.12781-1 - 2025/01/12 (日) 07:42:12 - ４５５６ 先週たまたま細胞を蒔いたwellが余ったのでついでにやった実験で、培養細胞にある処理をして蛍光免疫染色(IF)であるタンパク質の発現や分布を見たら、発現が無処理群と比べて（輝度で）５倍くらい増加（目視したら秒でわかるくらい明らかに違う）してることに気がつきました。細胞内分布（細胞膜）には差異はなかったです。で、これ、もしかなんかあるかもと思い、同じ処理した細胞について昨日WBでも調べたら無処理群と処理群では発現量には全く差はありませんでした。それはそれで面白いとも思うのですが、半分そんなことあるのかなあ？とも思い、ここでやめて深入りしないか、それともさらに進めるか考え中です。発現量についてIFとWBで結果が大きく違う経験ある人いますか。他のタンパク質の既知の事例でそんなことが過去にあるかどうかどうか知りたいので。

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