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(無題) 削除/引用 No.12779-20 - 2025/01/18 (土) 00:56:38 - おお PCRに頼らないならあとはHybridizationを利用した検出方法とか？

(無題) 削除/引用 No.12779-19 - 2025/01/17 (金) 12:36:49 - あの 念のため補足しますが、DNAベースの分析の場合には、次の濃度スタンダードの使用を推奨します： 　 　細菌DNA溶液をヒトDNA溶液も用いて段階希釈（qPCRなら10倍希釈）したもの

(無題) 削除/引用 No.12779-18 - 2025/01/17 (金) 06:08:51 - あの 患者間の比較って。。。 通常PCRでは数十ナノグラム程度のDNAを材料とするけど、病的状態とはいえヒトゲノムDNAの中に混在できる細菌DNAの量って、十分な量が安定してありえるのかが疑問です。 ワンコピーあればPCR増幅できると考えることが一般だけど、プライマー配列によっては、そうはいかないでしょうし。 どうしてもDNAベースの解析に限るとすると、強いて言うと、メタゲノム解析かな？予算さえあれば、受託会社にサンプル送るだけでできる。納期は1か月以上だけど。

(無題) 削除/引用 No.12779-17 - 2025/01/17 (金) 06:03:20 - おお https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0362028X22129248 You might want to read it.

(無題) 削除/引用 No.12779-16 - 2025/01/17 (金) 05:56:44 - おお >[Re:12] CALさんは書きました : > > ＞汎細菌の配列を増幅できるユニバーサルプライマーを使えばいい。 > これは他に選択肢はないと思いますが、細菌腫によって、内部配列はバラバラなので、qPCRであれば、増幅効率はバラバラですよね。 > メジャー菌種がわかっているならそれぞれの配列の効率を調べてみるのも手じゃないでしょうか（あるいは調べられているかもしれない）？そんな予想もできない菌がうじゃうじゃいるような状況なんでしょうか？ 以下の文献では実際に調べている。 https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC5368227/#s7 Primer pair efficiency ...Similarly, no significant differences were found in amplification efficiency or sensitivity of the reference strains (Supplementary Figure 10).

(無題) 削除/引用 No.12779-15 - 2025/01/17 (金) 05:33:04 - おお >[Re:10] G25さんは書きました : > 代表的なのは16S rRNAだけれどrRNA遺伝子は多重遺伝子でしかも種によってコピー数が違うことに注意。ユニーク遺伝子のほうがいいかもgyrBとか gyrBがつかえるならそれがいいですね。勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.12779-14 - 2025/01/16 (木) 23:43:53 - G25 想像であれこれ難癖つけるんじゃなくて、ちゃんと勉強してみたらいがですか。 基本的な知識がある上でプラクティカルな問題をディスカッションするならいざ知らず、一般的に用いられている手法にすら難癖つけられてはたまりません。

(無題) 削除/引用 No.12779-13 - 2025/01/16 (木) 23:40:59 - おお >[Re:12] CALさんは書きました : > ＞qPCRの絶対定量 > > この場合においては、スタンダードは長鎖オリゴの溶液になるのでしょうか。論理だけではうまくいくようにも思えますが、実は単に定量したいだけではなくて、患者間の比較をしたいと思っています。ですので、正確性をかなり担保できる手法を用いたいと考えています。 人細胞数の見積は培養細胞からDNAをとりスタンダードにすればいい｡因みに1細胞6p gと見積もられているらしい。 バクテリア用のオリゴ、または大腸菌のDNAを人細胞のDNAに混ぜた状態でスタンダードにすればより現実に近い｡ 必要ならそう言う工夫ができますよ。 > > 今回のような様々なゲノムの混在した多様性の高いサンプルに対しては、PCRをするにしても、様々なファクターが作用して、正確な定量性が担保できるのか、少し考える余地がある気がしています。片側のプライマーが他のゲノム配列に引っ張られれば、増幅効率も多少は変化するようなこともあるかもしれませんので、スタンダードの検量線だけをうのみにもできない気がします。 > > ＞汎細菌の配列を増幅できるユニバーサルプライマーを使えばいい。 > これは他に選択肢はないと思いますが、細菌腫によって、内部配列はバラバラなので、qPCRであれば、増幅効率はバラバラですよね。 > これも定量性を左右するファクターだと思います。また、そもそも、qPCRのスタンダードを使用しようにも、どう設定するのが妥当なのか、、、、これは簡単には解決できなさそうですね。 > > > > https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666166722006451 これ読んだ？

(無題) 削除/引用 No.12779-12 - 2025/01/16 (木) 23:10:23 - CAL ＞qPCRの絶対定量 この場合においては、スタンダードは長鎖オリゴの溶液になるのでしょうか。論理だけではうまくいくようにも思えますが、実は単に定量したいだけではなくて、患者間の比較をしたいと思っています。ですので、正確性をかなり担保できる手法を用いたいと考えています。 今回のような様々なゲノムの混在した多様性の高いサンプルに対しては、PCRをするにしても、様々なファクターが作用して、正確な定量性が担保できるのか、少し考える余地がある気がしています。片側のプライマーが他のゲノム配列に引っ張られれば、増幅効率も多少は変化するようなこともあるかもしれませんので、スタンダードの検量線だけをうのみにもできない気がします。 ＞汎細菌の配列を増幅できるユニバーサルプライマーを使えばいい。 これは他に選択肢はないと思いますが、細菌腫によって、内部配列はバラバラなので、qPCRであれば、増幅効率はバラバラですよね。 これも定量性を左右するファクターだと思います。また、そもそも、qPCRのスタンダードを使用しようにも、どう設定するのが妥当なのか、、、、これは簡単には解決できなさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.12779-11 - 2025/01/16 (木) 19:40:04 - G25 >[Re:3] CALさんは書きました : > 人の遺伝子Aとバクテリアで共通している遺伝子Bの相対比でしょうか？ > > 異なる分子をどうやって比較するのでしょうか。 > qPCRで疑似定量はできるのは、感覚的にわかりますが、あくまでかなりラフな定量になる気がします。 なんかものすごく勉強不足のにほいがするぞ

(無題) 削除/引用 No.12779-10 - 2025/01/16 (木) 19:38:29 - G25 >ヒトと細菌で共通した配列がないのに、どうやって絶対定量するのでしょうか。 ヒトのDNAと細菌のDNAを同時に増幅するということじゃないぞ。 ヒトのもつ配列、細菌のもつ配列、それぞれのqPCRで絶対量（絶対数）をもとめれればいいだけじゃないか。絶対定量にはもちろん同じ配列をもつ既知量のDNAをスタンダートにする。 特定の細菌種をカウントするならその細菌に特異的な配列にプライマーを設定すればいいでしょう（同属異種くらいはクロスしてしまうでしょうけど）。 細菌を種に関係なくをカウントするなら、汎細菌の配列を増幅できるユニバーサルプライマーを使えばいい。 代表的なのは16S rRNAだけれどrRNA遺伝子は多重遺伝子でしかも種によってコピー数が違うことに注意。ユニーク遺伝子のほうがいいかもgyrBとか

(無題) 削除/引用 No.12779-9 - 2025/01/16 (木) 13:27:16 - おお >[Re:8] CALさんは書きました : > > ＞qPCRはリファレンスを置けば絶対定量できますけどね。 > qPCRで疑似定量の定義をください。 > > ヒトと細菌で共通した配列がないのに、どうやって絶対定量するのでしょうか。 スタンダードを置くと申し上げてます。qPCRで絶対定量できるのはご存知ですよね。 > > 上記とは別の情報ですが、実は、一種類の細菌ではなく、細菌vsヒトの細胞ということになります。細胞の核ゲノムのcopy数も様々だと思うので、いずれにしても、概算値になると思いますが。 > > 調べるとそうみたいですね。大体どのようなバクテリアがいるのか検討つくならそれぞれ調べてみてもいいかもしれない。 https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3031548/ ところでバクテリア全部網羅的に検出するならばrRNAをコードする領域になることがたいていと思いますが、たしかそうするとrRNA遺伝子はゲノムに複数個あって種によっても違うかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.12779-8 - 2025/01/16 (木) 09:49:06 - CAL ＞セルソーター これは実験のデザイン上できません。基本的には、DNAサンプルからの推定になります。 ＞qPCRはリファレンスを置けば絶対定量できますけどね。 qPCRで疑似定量の定義をください。 ヒトと細菌で共通した配列がないのに、どうやって絶対定量するのでしょうか。 上記とは別の情報ですが、実は、一種類の細菌ではなく、細菌vsヒトの細胞ということになります。細胞の核ゲノムのcopy数も様々だと思うので、いずれにしても、概算値になると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12779-7 - 2025/01/13 (月) 06:26:39 - おお >qPCRで疑似定量 疑似定量の定義をください。

(無題) 削除/引用 No.12779-6 - 2025/01/12 (日) 19:16:17 - あの セルソータとは思いつきであげましたが、条件設定する予備実験は必要になるでしょうね。 それから、もう少し情報を提示できないですか？ どういう細菌かわかっているのかとか、ヒト組織は何かとか。

(無題) 削除/引用 No.12779-5 - 2025/01/12 (日) 19:09:27 - あの セルソータ。

(無題) 削除/引用 No.12779-4 - 2025/01/11 (土) 08:21:50 - おお qPCRはリファレンスを置けば絶対定量できますけどね。 >人の遺伝子Aとバクテリアで共通している遺伝子Bの相対比でしょうか？ 別に共通してなくても良いし、なんなら共通していないほうが特異性という点でメリットが有る。 ヒト細胞は特殊な場合を除いては細胞内に２コピー。バクテリアはゲノムは１コピー（特殊な場合を考慮すべきかはわからないけど）。バクテリアのDNAの絶対量がヒトゲノムに比べて無視できる程度ならヒト特異的なPCRはいらないかもしれない。 多分そういう研究は探せば色々出てくるんじゃないか？ウイルスなんかでも血液１ml中なんコピーとかで表されてたりする場合もありますし。

(無題) 削除/引用 No.12779-3 - 2025/01/11 (土) 07:45:36 - CAL 人の遺伝子Aとバクテリアで共通している遺伝子Bの相対比でしょうか？ 異なる分子をどうやって比較するのでしょうか。 qPCRで疑似定量はできるのは、感覚的にわかりますが、あくまでかなりラフな定量になる気がします。

(無題) 削除/引用 No.12779-2 - 2025/01/11 (土) 06:26:53 - おお コピー数がわかればいいだけの話では？

組織中の人間の細胞と細菌の割合を推定する方法 削除/引用 No.12779-1 - 2025/01/11 (土) 05:35:36 - CAL ある臨床検体を回収したのですが、この組織中のヒトの細胞と細菌の比率を推定する方法はありますでしょうか。 細胞数での比較を行いたいと考えていますが、何かいいアイデアはありますでしょうか。

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