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(無題) 削除/引用 No.12761-8 - 2024/12/29 (日) 17:39:47 - 2 精製した後、それを何に使うのでしょうか。やってみるとわかりますが血清や血漿から比較的微量のタンパク質を高度に精製する（銀染色でほぼシングルバンドの純度）のはかなり大変な仕事になるのだけど、部分精製レベル（コンタミが多くても精製画分の中の主要タンパク質になればいいレベル）でも構わないとかそういう感じ？。 塩析するならば、塩濃度は少なくとも数十mMのオーダーまで脱塩して下げておいた方がいいです（ただあまり下げすぎるとそれはそれでまずいことが起きます）。塩析の目的が単に濃縮だけでなく同時に分画も考えているならば特に脱塩はした方がいいです。脱塩は市販の脱塩カラムが簡単だし早くて便利です。特に失活しやすいタンパク質は手早く処理できる点では透析よりも優れてます。ベッドボリュームとサンプル量の比率には注意しないと脱塩が不完全になります。特に脱塩カラムはロードできる試料体積が制限されますのでサンプル容積がおおきいときは不向きです。 縁石については、試料をbufferで希釈して塩濃度を下げてそこに固形硫安を加えてゆっくり撹拌してよく溶かしてから、４℃で一晩静置してもいいです。塩析は簡単で、硫安はタンパク質にも保護的なので精製・濃縮法として良い方法と思いますが、欠点はある程度試料のタンパク質濃度が高くないと沈殿形成に時間がかかり、時には沈殿がうまく形成できなかったりすることもあります。

(無題) 削除/引用 No.12761-7 - 2024/12/29 (日) 05:50:09 - あの 念のため確認です。もし血漿の場合ですが、提供元では、フィブリンは除去してくれているのですね？

(無題) 削除/引用 No.12761-6 - 2024/12/29 (日) 03:48:05 - あの 最近はこの手の仕事はしていませんが、脱塩後の透析チューブに、乾燥したゲル濾過用の粉状のゲルをまぶすというプロトコルを昔見たことあります。 問題は、透析チューブからの回収の段階で、ロスが多いこと。めんどくさいし。 そのため、スピンカラムの方が楽でしょうね。

(無題) 削除/引用 No.12761-5 - 2024/12/28 (土) 19:44:18 - あかね 血中からアフィニティ精製ってことは、溶出後のサンプル濃度はそれほど高くないでしょう。 おそらく、高塩濃度のまま濃縮したのがまずい。 私なら、透析脱塩 > アミコン が第一選択。 硫安は、失活するリスクもあることを考慮すると優先順位はひくい。

(無題) 削除/引用 No.12761-4 - 2024/12/28 (土) 17:11:49 - おお >[Re:2] おおさんは書きました : > 透析チューブなどの入れて脱塩したのちチューブを透過しない大きな分子の水溶液につけると、チューブ内の水分は抜けていきます｡ > > https://www.emdmillipore.com/US/en/product/Aquacide-II,EMD_BIO-17851 > > 商品名を見ると特殊な感じだけど中身はcarboxymethylcelluloseです。 なんとなくアガロースやグリコーゲン、フィコール、乾燥したセファデックスとかでもできそうな気がしてきた。

(無題) 削除/引用 No.12761-3 - 2024/12/28 (土) 05:31:38 - おお >3M塩化カリウム これぐらいの高い塩濃度だと疎水クロマトをかけれるかもしれませんね。疎水クロマト用樹脂でもいいのですが、ゲルろ過で使われるような支持体オンリーのものでも疎水相互作用で結合する可能性があります。カラムにつくなら低塩濃度で溶出すればそんなに蛋白濃度を落とさない状態で回収できることがおおいです。それでステップワイズでも高塩濃度と低塩濃度の間付近から溶出されてくるので一応透析でバッファー置換したほうが良さそうです。

(無題) 削除/引用 No.12761-2 - 2024/12/27 (金) 21:39:52 - おお 透析チューブなどの入れて脱塩したのちチューブを透過しない大きな分子の水溶液につけると、チューブ内の水分は抜けていきます｡ PEGとかでやれますが、私がやった時はチューブ内のタンパクが沈澱してしまいました。おそらく純度の問題で低分子PEGが混在してそれがチューブに侵入したのかなと思ってます｡PEGよりもタンパク質を沈澱させる能力がないものならそう言う心配はないかなと思いますが、例えば以下のようなもの https://www.emdmillipore.com/US/en/product/Aquacide-II,EMD_BIO-17851 商品名を見ると特殊な感じだけど中身はcarboxymethylcelluloseです｡溶液を作りそこの入れてもいいし、直接粉をぶっかけてもいいと書いてます(PEGでも粉かけるというやり方を見たことがある)。溶液でもいいけどドロドロしてチューブが沈まなそうだから乗せるような感じかな。。。 ここで誰かが言ってたのは、透析チューブに入れてコールドルームで干しておくって言うのがありました。まあ、実際にチューブにサンプルを入れてチューブ越しにバキュームすると水が滲み出てきて濃縮できます(そう言う方法論はある)。

凝集しにくい脱塩濃縮法 削除/引用 No.12761-1 - 2024/12/27 (金) 19:51:52 - おぼろ 現在、血液中から特定のインタクトタンパク質を精製したいと考えています。 現在、アフィニティ精製により、3M塩化カリウムによって溶出したサンプルを共同研究先から入手していますが、これを脱塩し、かつ液量を一定以上濃縮するための適切な方法をご教示いただきたいです。 すでに、アミコンカラムを使用したが、凝集しすぎて使い物にならなかったため、現在は「透析→硫安沈殿→透析」の順で低塩濃度のサンプルを得ようと考えていますが、3M塩化カリウムに対して直接硫安沈殿は可能でしょうか？ 高濃度の塩溶液に対する硫安沈殿の報告があれば、ぜひご教示いただければ幸いです。

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