全4件 ( 1 ～ 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12751-4 - 2024/12/22 (日) 17:07:56 - おお どんなストラテジーで環状化をしようとしているのかよくわからないのだが｡プライマーで伸長しただけでは環状にはならないし、プラスミドのori のようなものを利用しないなら、環状になってないものも混じっていて分離する必要もあるし、環状ができても収量が低い方法論もあるし。

(無題) 削除/引用 No.12751-3 - 2024/12/22 (日) 15:09:10 - amam 詳しくありがとうございます！ さらに詳しくお聞きします。 例えば、①と③が5´側、②と④が3´側となっている二本の配列を繋げるとしたら、①②③④の順に並び、②と③の間と①と④の間にそれぞれプライマーが必要になってくると思いますが、上流が②と④、下流が①と③になるということですか？ ①ACCGTAGGCTACCCTAA....................AATTGTCCGATCGAT② ③CGCGCCTAAGTATGTGG.....................TGTCTGACTAGGTT④ 実際に設計する際、②の700bpを入力するとフォワードとリバースが出てきますが、この過程を①②③④すべてやればよいということでしょうか？ 設計初心者のため何もわからず文もわかりにくくすみませんが教えてください！

(無題) 削除/引用 No.12751-2 - 2024/12/22 (日) 14:42:43 - GPT 非環状化ゲノムを環状化するためには、上流（5'末端）と下流（3'末端）の部分を効率よく結合させる必要があります。その際にプライマー設計が重要です。以下に具体的な手順とポイントを説明します： 1. 上流と下流の決定 上流部分: 非環状ゲノムの5'末端の配列。 下流部分: 非環状ゲノムの3'末端の配列。 上流と下流部分を選ぶ際には、配列の末端が適切にペアリングしやすいように、相補的な配列を考慮する必要があります。 2. プライマー設計 基本設計: プライマーは上流と下流の配列をつなぐ部分をターゲットにします。 フォワードプライマー: ゲノムの上流部分に結合するプライマー。 リバースプライマー: 下流部分に結合するプライマー（配列は逆相補的）。 環状化の場合: プライマーは以下のように設計します： 上流末端の数十塩基（10–20 bp程度）をターゲットにする配列。 下流末端の数十塩基（10–20 bp程度）をターゲットにする配列。 このとき、上流と下流の配列間で適切なオーバーラップや相補性を持つ配列があれば、それを利用して結合効率を高めます。 3. 環状化の手法 環状化には以下の方法が用いられることが一般的です： a. PCR法（ポリメラーゼ連鎖反応） 上記で設計したプライマーを使い、ゲノム末端の増幅を行う。 PCR産物を用いて、5'末端と3'末端を結合させる。 b. ライゲーション法 PCR産物やゲノム断片をDNAリガーゼを使用して環状化する。 c. ゲル抽出後の環状化 PCR後に生成物をゲル精製し、目的のDNA断片を取り出してリガーゼ反応で環状化する。 4. 注意点 配列の適合性: 上流と下流の配列に変異や二次構造が存在しないことを確認してください。 プライマー特異性: 設計したプライマーが他の非標的領域に結合しないようにします。 リガーゼ反応条件: 温度や時間など、最適な反応条件を選択する必要があります。 詳細な配列があれば、さらに具体的なプライマー設計や結合部位の提案も可能です！

プライマーデザイン！！ 削除/引用 No.12751-1 - 2024/12/22 (日) 14:31:40 - amam 非環状化であるゲノムを環状化にするためにプライマーが必要です。 現在、２本に分かれています。 上流と下流部分はどこにすればよいのでしょうか

全4件 ( 1 ～ 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---