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プライマーデザイン！！ トピック削除
No.12751-TOPIC - 2024/12/22 (日) 14:31:40 - amam
非環状化であるゲノムを環状化にするためにプライマーが必要です。
現在、２本に分かれています。
上流と下流部分はどこにすればよいのでしょうか
　
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No.12751-4 - 2024/12/22 (日) 17:07:56 - おお
どんなストラテジーで環状化をしようとしているのかよくわからないのだが｡プライマーで伸長しただけでは環状にはならないし、プラスミドのori のようなものを利用しないなら、環状になってないものも混じっていて分離する必要もあるし、環状ができても収量が低い方法論もあるし。

(無題) 削除/引用
No.12751-3 - 2024/12/22 (日) 15:09:10 - amam
詳しくありがとうございます！

さらに詳しくお聞きします。
例えば、@とBが5´側、AとCが3´側となっている二本の配列を繋げるとしたら、@ABCの順に並び、AとBの間と@とCの間にそれぞれプライマーが必要になってくると思いますが、上流がAとC、下流が@とBになるということですか？

@ACCGTAGGCTACCCTAA....................AATTGTCCGATCGATA

BCGCGCCTAAGTATGTGG.....................TGTCTGACTAGGTTC

実際に設計する際、Aの700bpを入力するとフォワードとリバースが出てきますが、この過程を@ABCすべてやればよいということでしょうか？

設計初心者のため何もわからず文もわかりにくくすみませんが教えてください！

(無題) 削除/引用
No.12751-2 - 2024/12/22 (日) 14:42:43 - GPT
非環状化ゲノムを環状化するためには、上流（5'末端）と下流（3'末端）の部分を効率よく結合させる必要があります。その際にプライマー設計が重要です。以下に具体的な手順とポイントを説明します：

1. 上流と下流の決定
上流部分: 非環状ゲノムの5'末端の配列。
下流部分: 非環状ゲノムの3'末端の配列。
上流と下流部分を選ぶ際には、配列の末端が適切にペアリングしやすいように、相補的な配列を考慮する必要があります。

2. プライマー設計
基本設計:
プライマーは上流と下流の配列をつなぐ部分をターゲットにします。
フォワードプライマー: ゲノムの上流部分に結合するプライマー。
リバースプライマー: 下流部分に結合するプライマー（配列は逆相補的）。
環状化の場合:
プライマーは以下のように設計します：

上流末端の数十塩基（10–20 bp程度）をターゲットにする配列。
下流末端の数十塩基（10–20 bp程度）をターゲットにする配列。
このとき、上流と下流の配列間で適切なオーバーラップや相補性を持つ配列があれば、それを利用して結合効率を高めます。

3. 環状化の手法
環状化には以下の方法が用いられることが一般的です：

a. PCR法（ポリメラーゼ連鎖反応）
上記で設計したプライマーを使い、ゲノム末端の増幅を行う。
PCR産物を用いて、5'末端と3'末端を結合させる。
b. ライゲーション法
PCR産物やゲノム断片をDNAリガーゼを使用して環状化する。
c. ゲル抽出後の環状化
PCR後に生成物をゲル精製し、目的のDNA断片を取り出してリガーゼ反応で環状化する。

4. 注意点
配列の適合性: 上流と下流の配列に変異や二次構造が存在しないことを確認してください。
プライマー特異性: 設計したプライマーが他の非標的領域に結合しないようにします。
リガーゼ反応条件: 温度や時間など、最適な反応条件を選択する必要があります。
詳細な配列があれば、さらに具体的なプライマー設計や結合部位の提案も可能です！

プライマーデザイン！！ 削除/引用
No.12751-1 - 2024/12/22 (日) 14:31:40 - amam
非環状化であるゲノムを環状化にするためにプライマーが必要です。
現在、２本に分かれています。
上流と下流部分はどこにすればよいのでしょうか
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