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混合（縮重）塩基を含むプライマーを設計したい トピック削除
No.12747-TOPIC - 2024/12/20 (金) 17:13:20 - S.H
　現在、プロテインシーケンサーの結果を基に塩基配列の解明に取り組もうとしています。プロテインシーケンサーの結果には混合（縮重）塩基が含まれており、これらの塩基含むプライマーを設計したいと考えております。GSPプライマーを設計する際にはPrimer3を使用しているのですが、このような場合は何かおすすめのソフトや方法などはありますでしょうか。
　当研究室では混合（縮重）塩基の際は、基本GENETYXでプライマーの設計する場所をずらして確認を繰り返す方法が用いられているのですが、その方法だと途方もない作業になってしまうため、質問させていただきました。
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.12747-5 - 2024/12/21 (土) 02:36:14 - おお
https://www.researchgate.net/figure/LC-series-degenerate-primers-A-Primers-were-designed-to-discriminate-between-MSAS-type_fig1_12938013

これとかイノシンを使ってますね。

(無題) 削除/引用
No.12747-4 - 2024/12/21 (土) 02:34:23 - おお
目的はなんでしょうかねぇ。とりあえず配列を決めてそこから通常のプライマーで増やすとかならベストな場所の候補をいくらか設けてかかったところから配列を決めていって、通常のプライマーが使えるようにするというのもありかもしれません。

個人的にはソフトにプライマーを設定することはしていません。というのは個々の部分がいるという場合プライマーの位置は動かせないし、それでもPCRはかかることがたいていだからです。

Tm値の差はタッチダウンで解決できる場合も多いかもしれません。バリエーションが増えすぎる場合はイノシンを入れてもいいかもしえません。イノシンが多いとあまり良くないという話も聞いたことがありますが。

これは参考になりますか？
https://science.umd.edu/biology/cichlid/protocols/Basic/pcrdegenpri.html

(無題) 削除/引用
No.12747-3 - 2024/12/20 (金) 18:41:47 - Ca
私はmix塩基のプライマーの設計をする際は以下のサイトで行ってます。

IDT
https://sg.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer

一般的に用いられているmix塩基の記号で見れます。
Yであれば、C, Tなど
設計したプライマーのmix塩基も考えて最大最小のTm値も算出してくれるので重宝しています。

しかし、mix塩基が多いほど最大最小のTm値の差が大きくなるので、アニーリング温度の設定が難しくなりますので、
774Rさんがおっしゃっているように、できるだけmix塩基が少ない場所で設計することをお勧めします。

(無題) 削除/引用
No.12747-2 - 2024/12/20 (金) 18:17:55 - 774R
前提として塩基配列が未知の生物種ということですね？
今どき、ゲノムやcDNAが読まれてない研究対象とはレアですね。

＞プロテインシーケンサーの結果には混合（縮重）塩基が含まれており

について確認ですが、プロテインの配列なのに塩基とは？
アミノ酸配列から予測される塩基配列に縮重があるということでしょうか？
だとしたらメチオニンとトリプトファン以外は縮重があるので当然そうなりますよね。

極力、縮重の少ないアミノ酸を多く含む領域にプライマーを設計すると良いのでは？

混合（縮重）塩基を含むプライマーを設計したい 削除/引用
No.12747-1 - 2024/12/20 (金) 17:13:20 - S.H
　現在、プロテインシーケンサーの結果を基に塩基配列の解明に取り組もうとしています。プロテインシーケンサーの結果には混合（縮重）塩基が含まれており、これらの塩基含むプライマーを設計したいと考えております。GSPプライマーを設計する際にはPrimer3を使用しているのですが、このような場合は何かおすすめのソフトや方法などはありますでしょうか。
　当研究室では混合（縮重）塩基の際は、基本GENETYXでプライマーの設計する場所をずらして確認を繰り返す方法が用いられているのですが、その方法だと途方もない作業になってしまうため、質問させていただきました。
よろしくお願いいたします。
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