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(無題) 削除/引用 No.12744-16 - 2024/12/21 (土) 10:47:22 - toto >[Re:15] おおさんは書きました : > Phi29Phi29は１００kbまで正確に伸長できるエンザイムと言われてますが、通常のPCRのような使い方は見かけないですね。 > > 方法論を模索すればできるかもしれませんが。 えっと、私が書いた、primerをその末端にして、という意味は、普通phi29で使われるランダムヘキサマーでなくて、どちらか末端のspecific primerにしたら一番長いのができる確率が増えるだろう、ということでした。 ただ、昔、PCRの発案者がDNA polymeraseで最初やってたように、各サイクルごとにpolymeraseを追加する、というのをphi29で繰り返せば、100kでもふえるのかな？ばかげてますかね。20回くらいならやってもいいかも。ちなみに最近のPhi29改良型では100kよりもっと延びるようです。

(無題) 削除/引用 No.12744-15 - 2024/12/21 (土) 02:12:25 - おお Phi29Phi29は１００kbまで正確に伸長できるエンザイムと言われてますが、通常のPCRのような使い方は見かけないですね。 方法論を模索すればできるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.12744-14 - 2024/12/20 (金) 16:27:44 - toto なかなか難しいですね。PrimeSTARで50kが増やせるとメーカーはいっても、whole genomeからは（ですよね？）厳しいのではないでしょうか。Q5 polymeraseでは最大20Kといいますし、他の一般的なKOD系のでも、たとえば10k程度はプラスミドからでは増やますが、経験としてはどれを使ってもwhole genomeから10K以上を増やせた事はありません。下手だからかもしれませんが。 ただ、gBlock等で合成DNAを5kくらいのを20個作って、のりしろを作っておいて、それをNEBuilder/InFusionすれば、おそらく100kのも最終産物に含まれるはずではあります。ただ、その一番長い100kbのをどうやって増やして、他から分離するか、が、実際にはかなり苦労しそうです。たくさんクローニングすれば、最後の100kの増幅は要らないはず、ではありますが、こういう長い物を多数繋いだあとの反応産物の直接のサブクローニングはうまくいった試しがありません。 Phi29のようなのを使って、特にprimerを末端のにすれば、量は増やせるので、あとはクローニングをがんばればできるかも、という気はしますが、お金をそれまでに随分費やすことになり、踏み切れるかどうか。。。 あと、sequenceはナノポア使えば100k位はわけないので、外注でも安くやってくれますよ。

(無題) 削除/引用 No.12744-12 - 2024/12/20 (金) 12:29:59 - 漣 >>弘法さん 大変興味深い文献ありがとうございます。 コストがかなりかかりそうですが、最終手段として覚えておきます。 >>774Rさん 製品の紹介ありがとうございます。 50kbpを複数作成して、In-fusionが今のところ一番現実的でしょうか。 >>T-2さん コメントありがとうございます。 やはり今回やりたいことそのものが新規性のようですね。 Infusionは現実的な方法として具体的な方法を考えてみたいと思います。 今になって思いましたが、この配列を検証するのもNGSが必須で費用が掛かるのは避けられなさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.12744-11 - 2024/12/20 (金) 09:30:21 - T-2 100kbpをいわゆるPCRで行うのは難しいのではないかな。 100kbpともなると反応で出てくるピロリン酸も無視できないし、 dNTPの供給も必要になってくるかも。エラーも無視できないし。 10kbpを10本でIn-Fusionするのが現実的では。

(無題) 削除/引用 No.12744-10 - 2024/12/20 (金) 09:18:46 - 774R 50kb以上いける奴はあるみたい。 昔じゃ考えられなかった。 https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100009746&pdt_tok

(無題) 削除/引用 No.12744-9 - 2024/12/20 (金) 07:48:35 - 弘法 酵母を使うこんな方法があります。300kb（おそらくそれ以上）はいけるようです。 pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10750837/

(無題) 削除/引用 No.12744-8 - 2024/12/20 (金) 07:37:06 - 漣 ＞＞おおさん 配列は完全に分かっております。 既知のGenomeDNA配列の100kbp分のみをBACに導入したい形になります。

(無題) 削除/引用 No.12744-6 - 2024/12/20 (金) 00:57:24 - おお 配列は完全にわかっているものをBACに入れたいということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12744-5 - 2024/12/19 (木) 19:07:20 - 漣 ＞＞おおさん ご回答ありがとうございます。 おっしゃる通り、BACに特定の配列のみを導入したいと考えております。 ただ、研究コンセプトの都合上、genomeをそのまま断片化する方法は採用できません…… 複数の断片をInfusionで導入することも検討していますが、断片が多くなると成功率が懸念されます。何か良い方法をご存知でしたらご教示いただけますと幸いです。 ＞＞ TK-1さん やはりDNAポリメラーゼを用いたPCRでは困難なのでしょうか…… RCA試薬や全ゲノム増幅試薬の活用を試みてはいますが、現時点で効果的な手法を見出せておりません。もし有用なアイデアがありましたら、ご教示いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12744-4 - 2024/12/19 (木) 15:55:18 - TK-1 100 kbpの配列を2組の特異的プライマーを用いて増幅する方法を樹立すればそれだけで論文になるでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.12744-3 - 2024/12/19 (木) 15:39:53 - 774R 100kb x 250円　＝　2500万円

(無題) 削除/引用 No.12744-2 - 2024/12/19 (木) 15:13:50 - おお BACなどに組み込んで大腸菌に作らせる。 「100 kb超のDNAが合成できます」と言う謳い文句で合成受託している会社があるけど、どうだろう。 https://www.funakoshi.co.jp/contents/69993

100kboの直鎖2本鎖DNAを増幅したい 削除/引用 No.12744-1 - 2024/12/19 (木) 14:45:38 - 漣 現在、特異的な直鎖2本鎖DNAを取得するために、2組の特異的プライマーを用いる方法を検討しています。取得したいDNAの増幅部位は約100kbpと大きいため、通常のPCRでは技術的な限界があります。このような状況において、多少方法が変わっても構わないため、特定の配列を正確に増幅し、直鎖2本鎖DNAを取得する手法についてご教示いただけないでしょうか。

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