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脂肪組織からタンパク抽出　クロロホルム/メタノール沈殿 トピック削除
No.12743-TOPIC - 2024/12/19 (木) 08:11:03 - KAI
脂肪組織からタンパク抽出を行ってウエスタンブロットを行っています。

先日、脂質の混入などを考え、クロロホルム/メタノール沈殿を行ってみました。
1) サンプル + 水 + クロロ + メタ
2) 遠心　→　上澄み破棄
3) メタ
4) 遠心　→　上澄み破棄
5) 沈殿をバッファーにとかす


2つ質問があります。
A) 2)の段階で想像以上にでかい中層（茶色）が泡われました。
これは脂質とタンパクの複合だと理解し、triton X100を加え、1晩ローターで回転冷置。その後、ピペッティングし、それでも溶けていない塊は捨てました。その後、3）のメタノールに進みました。
BSAブラッドフォードによるタンパク濃度自体はかなり高いです。
Q1. この茶色い塊はやはり脂質+タンパクでしょうか？捨てて良かったでしょうか？

B)ウエスタンのバンドは何も出ませんでした。ポンソーも染まらなかったのでtransferが遮られていそうなので、nano dropで測定した所230nmが高いので、tritonX100を含む過剰な混入を考えています。
Q2. Tritonが原因でしょうか？その場合、フェノールクロロホルム沈殿で撮りぞのけますでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.12743-10 - 2024/12/21 (土) 08:14:32 - KAI
まあ目安として１００mgにたいして１０mgと書いたので組織によってはもう少し低いかもしれません。

はい、脂肪組織なのでこの5-10％くらいです。つまり必然的に組織/バッファーの量のバランスは悪くなります。

(無題) 削除/引用
No.12743-9 - 2024/12/21 (土) 05:56:17 - おお
>[Re:8] KAIさんは書きました :
> ありがとうございます。
>
> 問題そのものは解決していませんが、
> とにもかくにも、中間層を溶かすことを中心に考えて、

中間層は直接取らずにメタノールで沈殿させてから回収するのですが、そこはいいのでしょうか。

まあ目安として１００mgにたいして１０mgと書いたので組織によってはもう少し低いかもしれません。

少量で２回にわけて溶出するというのも手です。

(無題) 削除/引用
No.12743-8 - 2024/12/20 (金) 05:50:33 - KAI
ありがとうございます。

問題そのものは解決していませんが、
とにもかくにも、中間層を溶かすことを中心に考えて、組織量やバッファーなどをデザインすることが重要だというのが良く再認識できました。

(無題) 削除/引用
No.12743-7 - 2024/12/20 (金) 04:40:21 - おお
たとえば１００mgの組織なら１０mgの蛋白が取れると推測して、５から１０mlのバッファーで沈殿を溶かせば１mg/mlで電気泳動などで扱いやすい濃度になります。十分なバッファーで溶かしてますか？
たとえば１００mgの組織なら１０mgの蛋白が取れると推測して、５から１０mlのバッファーで沈殿を溶かせば１mg/mlで電気泳動などで扱いやすい濃度になります。十分なバッファーで溶かしてますか？
溶かすときUreaを使うとより溶けやすくなります。

> そのため、ある程度は溶かして、残りは捨てると言うプロセスを踏みました。
まあ仕方ない面がありますが、再現性が担保できる溶かし方をしないとと思いますが。文面だけをみるとすごく適当になっている感があります。

(無題) 削除/引用
No.12743-6 - 2024/12/20 (金) 02:52:09 - KAI
メタ/クロロホルム後の中間層ですが、イメージよりかなり大きくて以降のステップ（メタノール、あるいは1%SDS)で全部溶かすのは不可能な量です。
（私のはチューブですが、イメージとしては以下の写真くらいのインパクトです。）
https://www.soai.ac.jp/blogs/2020/11/post-430.html

おおさんがおっしゃられているように、
「場合によってはそれでも溶けないものが残ったりする。」

そのため、ある程度は溶かして、残りは捨てると言うプロセスを踏みました。

(無題) 削除/引用
No.12743-5 - 2024/12/20 (金) 00:24:45 - おお
1. To 200 μl protein sample, add 480 μl MeOH (filtered), 160 μl CHCl3 (filtered, add under the hood). Mix sample by vortexing. Add 640 μl ddH2O, vortex and spin 5 min at 14,000rpm.

2. Suck off the upper layer (***the proteins are between the two liquid phases: top-MeOH/H2O,bottom-CHCl3***) leaving a small amount of upper phase behind (use a thin gel-loading tip).

3. Add 300 μl MeOH, vortex and spin 30 min, 14,000 rpm, at 4°C.

4. Suck off supernatant completely (carefully) and air dry protein pellet.

5. Resuspend protein pellet in SDS sample buffer

https://commonfund.nih.gov/sites/default/files/Methanol-Precipitation-of-Protein.pdf

ちゃんとメソッドを確認したのだろうか、、、

>nano dropで測定した所230nmが高いので、
蛋白の吸収もそのあたりは非常に強いです。

(無題) 削除/引用
No.12743-4 - 2024/12/19 (木) 19:54:42 - 2
専門外なのでわからないことも多いですが、褐色脂肪組織もしくは白色脂肪組織でももしベージュ細胞とかが多く含まれているならばならば、これらの組織なり細胞はミトコンドリアがとてもたくさんあるので、茶色いのはメタノールなどで抽出されたヘム鉄のような気がします。lipid dropletのタンパク質など、この分野は過去に多くの生化学的研究がなされてきたと思うので、脂肪組織からのタンパク質の抽出方法は先行研究を丁寧に調査すれば目的に合う適切なものが見つかるような気がするのですが、あえて自分で試行錯誤でトライするのは何か理由があるのでしょうか。

western blottingが目的ならば、直接、組織をSDS-sample bufferで溶かして、DNAを剪断してから常温で遠心して上清を組織の総タンパク質として使えばどうでしょうか。変に分画してしまうと途中で捨てる画分に一部のタンパク質を失ってしまい、分析から抜け落ちるタンパク質が出てくる恐れがあるので。
SDSを含む試料の場合はタンパク質定量はBCA法になります。

(無題) 削除/引用
No.12743-3 - 2024/12/19 (木) 15:23:51 - おお
上清の液だけを捨てて、中間層に現れる不溶性のものは残したままメタノールで処理して沈殿したフラクションがタンパク。

沈殿は非常に溶けにくいのでTRITONぐらいで完全に溶出出来るか疑問。少なくとも1％ぐらいのSDSとかでボイルか高温で溶かさないと溶けないと思っていいかと。場合によってはそれでも溶けないものが残ったりする。

(無題) 削除/引用
No.12743-2 - 2024/12/19 (木) 09:06:26 - qq
読み違いかもしれませんが、、
Q1：捨てるべきではないように思います。沈殿を乾燥させサンプルバッファーと混ぜて、SDS-PAGEにかけてみればよかっただろうなと思います。
操作２で「上澄み廃棄」と書かれていますが、上澄みとはクロメタ水の上層のことですよね？
上層はメタ水層のことですが、捨てちゃうんですか？
下層にはクロロホルムに溶解する脂肪が抽出されていますが、あなたの調べたいタンパク質は、脂肪に溶解する特殊なタンパク質なのでしょうか？

＞BSAブラッドフォードによるタンパク濃度自体はかなり高いです。
これでタンパク質が回収できているはずと安心しているのではないかと思いますが、、、
クロロホルムをある程度含むメタノール水層をブラッドフォードで測定したとすると、バックグラウンドの高さが気になります。
ブランクをクロメタ水の下層を使えば少しは安心かもしれませんが、他のタンパク定量方法をお探しされてはいかがでしょう？

Q2:タンパクは中間層と廃棄した上層（？）に回収されていると思います。

脂肪組織からタンパク抽出　クロロホルム/メタノール沈殿 削除/引用
No.12743-1 - 2024/12/19 (木) 08:11:03 - KAI
脂肪組織からタンパク抽出を行ってウエスタンブロットを行っています。

先日、脂質の混入などを考え、クロロホルム/メタノール沈殿を行ってみました。
1) サンプル + 水 + クロロ + メタ
2) 遠心　→　上澄み破棄
3) メタ
4) 遠心　→　上澄み破棄
5) 沈殿をバッファーにとかす


2つ質問があります。
A) 2)の段階で想像以上にでかい中層（茶色）が泡われました。
これは脂質とタンパクの複合だと理解し、triton X100を加え、1晩ローターで回転冷置。その後、ピペッティングし、それでも溶けていない塊は捨てました。その後、3）のメタノールに進みました。
BSAブラッドフォードによるタンパク濃度自体はかなり高いです。
Q1. この茶色い塊はやはり脂質+タンパクでしょうか？捨てて良かったでしょうか？

B)ウエスタンのバンドは何も出ませんでした。ポンソーも染まらなかったのでtransferが遮られていそうなので、nano dropで測定した所230nmが高いので、tritonX100を含む過剰な混入を考えています。
Q2. Tritonが原因でしょうか？その場合、フェノールクロロホルム沈殿で撮りぞのけますでしょうか？
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