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(無題) 削除/引用 No.12737-12 - 2024/12/19 (木) 05:39:33 - あわわ 常温の転写バッファーは試したことがないのでやってみます。 重ねは練習ですね。頑張ってやってみます。

(無題) 削除/引用 No.12737-10 - 2024/12/18 (水) 05:27:25 - LPS 当方も、TransBlot Turboですので、転写バッファーもバイオラッド製のものを使用していますので、現在はSDS入りがデフォルトです。 一般に言えることですが，気体は低温のほうが溶存濃度が上がるので、作った転写バッファーは室温保存のほうが良いと思います。低温から室温に戻したときにカラムとかに泡の発生がみられることがありますよね。温度が上がって溶存可能な濃度が下がったためです。 転写のセットアップはすべて、カセット内でおこなっています。吸収ペーパー、やわらかくて膨張してしわになりやすいので。 カセット内に吸収ペーパーを置き、必要十分なだけのバッファーを垂らして濡らしたら、湿らせたメンブレンを置き、少量のバッファーをメンブレンに置いたのち、ゲルを載せて、最後に湿らせておいた吸収ペーパーを載せて、ローラーで軽くしごいたのち、カセットを閉じ、ロックして、傾けて余計なバッファーを捨てて転写開始です。ローラーのしごく向きは一方向のほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12737-9 - 2024/12/18 (水) 04:13:32 - あわわ いろいろなアイデアをありがとうございます。やはりヒタヒタですよね。ビデオもいくつか見たのですがあんなに軽く濡れてる程度で重ねてエアが入らないものなのかと思っていました。コロコロはもちろん使っています。ただゲルとメンブレンの間に小さな気泡が入っていたとして、サラリとコロコロしたところでエアは抜けないだろうなとは思っていました。 バッファーはおっしゃるように事前に作っております。当方も作りたてを使ったらうまくいかなかったことを経験しております。事前に作っておいて、そして冷やしておいたほうが泡が出ない印象です。ですので常に冷蔵保存しております。 機器はTrans-Blot Turboです。（上下に小さいボックスタイプのカセッテがある。）今考えているのはこのカセッテ内でひたひたにしつつ重ねて蓋を閉じる、蓋を閉じたあと斜めにして余分なバッファーを取り除いてからブロッティングする、と考えています。別場所でヒタヒタで重ねて、それをカセッテ内に持ってきて蓋閉じのほうがいいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12737-8 - 2024/12/17 (火) 19:04:25 - 774R 微細な泡も押しつぶすと結構デカくなるんですよね。 顕微鏡用の標本作製で、スライドガラスとカバーガラスを重ねてマウントするときも同じですね。

(無題) 削除/引用 No.12737-7 - 2024/12/17 (火) 17:31:08 - おお >[Re:6] LPSさんは書きました : > 転写バッファーを直前に作成していませんか。エタノールを加えると微細な泡が多数生じ、SDSが入っているので１０分くらいでは泡は抜けません。 SDSが入ってないレシピもメジャーだと思いますが、、、

(無題) 削除/引用 No.12737-6 - 2024/12/17 (火) 16:24:00 - LPS 転写バッファーを直前に作成していませんか。エタノールを加えると微細な泡が多数生じ、SDSが入っているので１０分くらいでは泡は抜けません。肉眼では見つけにくいくらいの小さな多数の泡が、転写中の熱で融合、あるいは膨張して、抜けたスポットになることはよく見かけます。これを避けるのは結構難しい。 一方、作り置きをしていたバッファーを使用する場合には、泡の経験はないと言っても過言ではないくらいです。 カセットの組み立てにも、吸収パッドがややひたひたに湿るくらいのバッファーしか使いません。ただ、メンブレンを置く場合、スポイトでバッファーを垂らしながら置くことはあります。またゲルを置く前にもメンブレンの上にもバッファを少し垂らして置くことはあります。

(無題) 削除/引用 No.12737-5 - 2024/12/17 (火) 14:55:53 - 2 気泡については濾紙などに吸収させるbufferの量がある程度多い方が失敗しないと思います。あまり意識して頑張って余剰のbufferを除いたことはありませんがエアで苦労したことないです。電極板に置いた段階でbufferが周囲にたくさん溢れて広い範囲で広がるとかでない限り（その場合は溢れた分はよく拭き取る）、余剰分のbufferは蓋閉めた段階でその重みでそれなりに濾紙からしみ出て除かれるので、無理に除く必要はないように思います。

(無題) 削除/引用 No.12737-4 - 2024/12/17 (火) 13:38:31 - 774R 私の場合、後で空気を抜くというのがどうにもうまく行かないです。最初から空気を入れないことが大事だと考えています。 十分に水没させられる深さのバットの中でゲルとメンブレンを重ね、そこから引き上げると泡が入らないです。

(無題) 削除/引用 No.12737-3 - 2024/12/17 (火) 11:09:27 - おお https://www.youtube.com/watch?v=0rMdsrgOzJU https://www.youtube.com/watch?v=Ys4iU9UopaQ >ヒタヒタにして重ねて、転写するとき余分なバッファーを取り除く まあそうですけど、ローラーみたいなので（なければ１０ml ピペットで必要なら半分ぐらいにきる）ころころさせて余分なバッファーとともに泡を追い出してます。てかウエットでもそうするんじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.12737-2 - 2024/12/17 (火) 08:40:48 - 泡まみれ研究者 基本的には >ヒタヒタにして重ねて、転写するとき余分なバッファーを取り除く というやり方でやってます。 TransBlot Turboでの話で、WBはテクニシャンにお願いしてます。Transfer Kitを買ってx5濃縮ストックから自前でx1バッファを作ってやるやり方を指示していました。メンブレン1-2枚に対して200mL程度のバッファを使ってヒタヒタにするやり方で、この時はエアバブルはほとんど入りませんでした。 が、自前でバッファを作るのが面倒になって、フィルターペーパーとメンブレンが個包装になってるTransfer Packを試したいと言ってきました。これはバッファが必要最小量（？）くらいしか入っていない製品です。まず何も言わずに試して貰ったところ、案の定エアバブルが入ってました。 このTransfer Pack、自分が過去に試した感じでは、エアバブルが入らないように意識して素早くやる（包装を開けたらメンブレンとフィルターペーパーの間のエアを素早く抜いて、ゲルも素早くセットする）必要があります。で、この話をしてからやってもらったのですが、それでもエアバブルが入ってしまうので、元のTransfer Kitに戻してもらったことがあります。 エアバブル対策では、バッファでヒタヒタにするのが一番簡単ではないだろうか？ 私はメンブレンを目的バンドサイズの前後で切ったりせず、一枚全面を使って行う必要があり、エアバブル対策がかなり重要なのでこうしています。 余分なバッファについて。TransBlot Turboでは、余剰バッファがあると転写効率が落ちる（ようだ）ので、セットした（フィルターペーパー、メンブレン、ゲルのセット）をフィルターペーパーの上からローラーで1-2往復した後、外側に出て来たバッファをキムワイプで吸い取ってからトランスファーを開始しています。

ウエスタンのトランスファー、セミドライのコツ 削除/引用 No.12737-1 - 2024/12/17 (火) 07:48:40 - あわわ ウエスタンでセミドライでトランスファーをしています。機器はバイオ・ラッドです。フィルター、メンブレン、ゲルを重ねますが、気をつけているつもりなのですが時々エアバブルが入ってしまいます。空気が入らないコツのようなものはありますか？ 以前はウエットで転写をしており、その時は何もかもバッファーでヒタヒタにして重ねて、エアが入っていることはほぼありませんでした。セミドライはバッファーをあまり使わないので重ねるときに空気が入っても見にくいのかな、と。ヒタヒタにして重ねて、転写するとき余分なバッファーを取り除く、などやっていますか？（そもそも転写の際バッファーはどのくらい入れればいいのでしょうか？） みなさんが工夫していること、気をつけていることを聞かせていただきたいです。よろしくお願いします。

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