BioTechnicalフォーラム [SDS-PAGEの空きウェルに入れるもの]

SDS-PAGEの空きウェルに入れるもの

No.12735-TOPIC - 2024/12/16 (月) 10:31:42 - あいうえお

よくある質問かもしれませんが、少し気になったので教えていただけますと幸いです。
バンドのスマイリングを防ぐため、空きウェルにも何か入れるといいとよく聞きます。RIPAバッファーで1×に希釈したサンプルバッファーをサンプルと同容量程度入れる、で良いのでしょうか。タンパク質が入っていない分軽そうな気がしますが、そこまで気にする必要はないでしょうか？
サンプルとタンパク質量を合わせるためBSAなどを入れた方が良いのかとも思いましたが、抗体がそちらに変に反応してしまいそうで、逆に良くないのかなとも思いました。
卒研用に失敗したくないサンプルがあり、気にしすぎかもしれませんが、有識者様教えていただけると嬉しいです。よろしくお願いいたします。
　

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No.12735-8 - 2024/12/17 (火) 04:08:20 - おお

こういう見方もしてみるといいでしょう。

蛋白による比重が重要なら２ug/laneは流せなくて、２０ug/laneは流せるとか言う話になってします。単独の蛋白を流して精製度をCBB染色でみたりするような場合は２０ug/laneも流しません（オーバーロードです）、１ug/laneぐらいでしょう（ゲルのサイズを上げるともっと載せれますが、１５cm x １５ cmとか）。

ちなみにレーンごとにタンパク量が違うとタンパク量が少ないレーンは先が細って、多いところは太くなるばあいもあります。ですので蛋白がないレーンにSample buffer＋RIPAをいれても完全にレーンの太さが揃うとも言えません（もちろん入っているSDSなどもレーンの太さに関係しているだろうと思えるので、意味がないとまで言いません。マーカーを流しておくという手はないことはないですが、抗体によっては反応したりすることもあります。

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No.12735-7 - 2024/12/17 (火) 03:51:46 - おお

>RIPAバッファーで1×に希釈したサンプルバッファーをサンプルと同容量程度入れる、で良いのでしょうか。

Yes.

指摘にありますようにグリセロールなどでサンプルバッファーの比重は調製されています。蛋白の影響を考える理由は何でしょうか？比重が泳動にどのように影響すると考えでしょうか。Wellからゲルに入った段階で溶液の比重は関係がなくなると思いませんか？グリセロールは電荷をもたず基本Wellにとどまりますし。

Wellに何もいれないばあい、隣のレーンが何も入れてないレーンに広がって何も入れてないレーンが細くなってしまうことがしばし起こります。

ちなみに私の場合自分でゲルを作った場合このようなことはほとんどおこらないので、基本なにも入れてません。またなにかいれると検出感度によってはケラチンと思われるghost bandsみたいなのが出てくることがあってそういうのを避けています。

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No.12735-6 - 2024/12/16 (月) 13:24:07 - 2

1x SDS-sample bufferをできればサンプルと等しい容量入れて泳動すれば良いです。サンプルのすぐ横のウェルを空にしないのはスマイリングの防止でなくバンドの横方向への拡散を防止するためと思います。もしも、サンプルを非還元条件で泳動する場合は、空きウェルに流すsample bufferも還元剤は入れないようにしましょう（影響受ける場合があるので）。

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No.12735-5 - 2024/12/16 (月) 13:04:02 - う

電流を減らして、温度が上がらないようにゆっくり流すのも効果があります。

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No.12735-4 - 2024/12/16 (月) 12:56:32 - あいうえお

比重の変化はほぼないんですね。
タンパク質なしのバッファーとサンプルバッファーで試してみます。うさん、774Rさんありがとうございます。

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No.12735-3 - 2024/12/16 (月) 12:11:21 - 774R

＞タンパク質が入っていない分軽そうな気がします

タンパク質による比重の変化はほぼないので気にしなくていいです。
サンプルバッファーに含まれるグリセロール等で必要な比重を達成しています。