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(無題) 削除/引用 No.12732-22 - 2024/12/18 (水) 03:23:41 - おお >[Re:21] 舞子さんは書きました : > 私はマイコプラズマ汚染の検査は比色分析でやっています。...ペレットは陽性で上澄みは陰性でした。検査するときはペレット中にいくつか細胞（かdebris）が入っていることは確認しています。ですので多少細胞がないと検出できないのかなと思っていたのですが、あるいはマイコプラズマ自体も落ちてる場合もあるのですね。 > 事情がわかりました。培養細胞の汚染検査では細胞にコンタミがあるかをみるうえで、（特に培地から）検出するための注意事項といいますか、Instructionがあります。培養を少なくとも３日間行い十分にマイコプラズマが培地に含まれる状態にする。できれば抗生物質が含まれない培地をつかうなど。 また細胞外にあれど、細胞に付着しているマイコプラズマも多いので細胞を回収するのがいいというのは理解できるところでもあります。

(無題) 削除/引用 No.12732-21 - 2024/12/18 (水) 00:20:43 - 舞子 私はマイコプラズマ汚染の検査は比色分析でやっています。今思い返すと検査法を選ぶ際に、PCRで検査すると当時は手技に自信がなかったのと高感度過ぎて検査中に何か失敗して偽陽性なったらイヤだなと思ってこちらにしたような気がします。使用している細胞がコンタミしているかしていないか（プラスかマイナスか）を見たいだけですのでわざわざPCRは面倒だなと当時は思っていましたが、今プロトコールを見ますと簡便にできるのですね。こちらでも上澄み遠心後のペレットを検査に使用するのですが、試しにその上澄みも一緒に検査したことがあります。ペレットは陽性で上澄みは陰性でした。検査するときはペレット中にいくつか細胞（かdebris）が入っていることは確認しています。ですので多少細胞がないと検出できないのかなと思っていたのですが、あるいはマイコプラズマ自体も落ちてる場合もあるのですね。 > 測定したいサンプルはすでに細胞除去してフィルターろ過し、液体だけにしたものです。 ちなみに0.1のフィルターにかける場合は、まず0.4か0.2に通して大雑把なdebrisを除いてからがいいと思います。いきなり0.1に通すと目詰まりを起こしてうまく培地が落ちてこないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12732-20 - 2024/12/17 (火) 19:22:51 - MM おおさん、舞子さん、たくさんの情報をくたさってありがとうございました。どれもとても勉強になりました。 おおさんの資料を見ると細胞内にいるものは培養上清にまったくいないことはないとも思えますし、舞子さんの絶対とは判断できないというのも一つの考え方かと思います。 説明が下手で混乱させてしまいましたが、個人の研究ではないのでこれ以上の条件説明は控えさせていただきます。 おかげさまでだいぶ頭の整理ができたので、試薬メーカーに質問してみます。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12732-19 - 2024/12/17 (火) 15:49:43 - TT マイコはマイクロチューブ遠心機14,000 rpmで沈殿します。そのため、1 ml → 50 ulの20倍濃縮相当の操作をしていることになります。ただし、もし沈殿が目視できるものがあったとしてもそれ自体はマイコというよりはdebrisだと思いますが・・・

(無題) 削除/引用 No.12732-18 - 2024/12/17 (火) 13:42:01 - おお >[Re:16] 舞子さんは書きました : > 私はマイコプラズマ汚染の検査は、 > > >マイコプラズマは細胞内寄生するので、細胞を取ってきてLysis > して検査するという認識です。 > 培養細胞でコンタミしたものを電顕で観察したデーターを見ますが、細胞外にあるマイコプラズマのほうが圧倒的に多いです。ですから、２０００年頃までは細胞内にするという認識はなく、培地からのPCRで十分評価できた。細胞内に入ったことによる病理的現象を見るのではなく、コンタミを確認するのであれば一応培地を見れば判定できるというのは細胞内にいることが確認されていなかった昔から経験的に示されてきています。

(無題) 削除/引用 No.12732-17 - 2024/12/17 (火) 13:32:40 - おお >[Re:16] 舞子さんは書きました : > 私はマイコプラズマ汚染の検査は、 > > >培養上清で陰性で、マイコプラズマは否定できる > これでは判断ができないと思っています。よっぽど感度が高いキットであればできるのかもしれませんが、 方法論的には１つマイコプラズマがいれば検出できるようになっています。これ以上高感度なものはないといってもいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12732-16 - 2024/12/17 (火) 13:12:03 - 舞子 私はマイコプラズマ汚染の検査は、 >マイコプラズマは細胞内寄生するので、細胞を取ってきてLysis して検査するという認識です。 >培養上清で陰性で、マイコプラズマは否定できる これでは判断ができないと思っています。よっぽど感度が高いキットであればできるのかもしれませんが、それはその会社に聞いてみないと。培地上澄みだけを検査したいということがないので。 マイコプラズマに感染していないコンディションメディアを作りたいのですか？それでしたらその培養している細胞がマイコプラズマフリーでしたらいいのでは。あるいはコンディションメディアを0.1umでフィルターしてから使用している研究室もあるかもしれませんね。そういう報告があればそれでもいいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12732-15 - 2024/12/17 (火) 12:58:05 - 舞子 >[Re:1] MMさんは書きました : > 細胞製品の品質試験や、細胞培養の汚染検査のマイコプラズマ汚染を調べるために、 培養している細胞がマイコプラズマに汚染されているのかどうかを調べるのでしたら、プロトコールのように、培養中の培地を1mL取って遠心してそのペレットを使用してPCRでいいと思います。 細胞製品の品質試験 これは培養している細胞についてではなくて、自分が持っている培養に使用していない培地にマイコプラズマが入ってしまっているのかどうかを試験したいということですか？それでしたらキットの会社に聞いた方がいいと思います。マイコプラズマは遠心で落ちるのですか？もしマイコプラズマが入っていても検出出来るレベルに達しているのかわからないのかもしれません。 不安でしたら新しく注文する、新しく作る、あるいは持っている培地をフィルターにかけるなどが考えられると思います。「細胞製品」が培地ならば。

(無題) 削除/引用 No.12732-14 - 2024/12/17 (火) 11:22:14 - おお https://www.emdmillipore.com/US/en/search/mycoplasma%20removable?search=&TrackingSearchType=SB+-+Search+Box&SearchContextPageletUUID=&SearchTerm=mycoplasma+removable Due to their small size and deformability, mycoplasma can penetrate a 0.2μm rated filter.

(無題) 削除/引用 No.12732-13 - 2024/12/17 (火) 10:39:44 - 舞子 https://www.invivogen.com/sites/default/files/invivogen/products/files/mycostrip-tds-invivogen.pdf これですか？ >[Re:1] MMさんは書きました : > 細胞を取ってきてLysis してそうですが。 >[Re:9] MMさんは書きました : > 測定したいサンプルはすでに細胞除去してフィルターろ過し、液体だけにしたものです。 どのステップでするのですか？

(無題) 削除/引用 No.12732-12 - 2024/12/17 (火) 03:39:17 - おお >[Re:9] MMさんは書きました : > > 培養上清を遠心したペレットを使うのですか？細胞除去、フィルターろ過も済ませたものを使うのですか？ > > 多少の細胞片が入っているような状態でないと、マイコのDNAが混じってこず偽陰性になってしまうということはないでしょうか。 フィルターのチョイスが適切ならないと思ってます。前のフィルターに関するコメントをお読みください。 > > 海外メーカーのkitなのでどう質問していいのかわからずこちらを頼らせていただきました。 商品名などの情報は開示できますか？ https://genetics.med.upenn.edu/cores/cell-center-services/services/cell-culture-services/ Since infected cells shed mycoplasma into the medium, testing the cell culture supernatant is sufficient to detect mycoplasma infection. We only need about 1ml of cell culture supernatant for testing. Please remove any cells that might be present by centrifugation.

(無題) 削除/引用 No.12732-11 - 2024/12/17 (火) 03:12:18 - 舞子 >[Re:9] MMさんは書きました : > kitについているプロトコールは、「1 ml of cell culture supernatant」を遠心後、上清を除いて50μL以下にし、PBSで懸濁した液をサンプルとしてPCRする、とあります。底にペレットができている図がついてます。 > 「Note: The pellet will be invisible except if some cells have been collected. > Importantly, their presence will not affect the detection assay.」 > とあり、見えないかもしれないけれど何らかの沈殿物を懸濁してPCRにかけているような表現に見えるのですが… > > 測定したいサンプルはすでに細胞除去してフィルターろ過し、液体だけにしたものです。 「1 ml of cell culture supernatant」を遠心後、上清を除いて50μL以下にし、PBSで懸濁した液をサンプルとしてPCRする、んですよね。 細胞除去してフィルターろ過はいつするんですか？ 「1 ml of cell culture supernatant」を遠心後、上清を除いて50μL以下にし、 の前？後？ 細胞除去してフィルターろ過するのはそのキットのプロトコールに載っているのですか？ > 海外メーカーのkitなのでどう質問していいのかわからずこちらを頼らせていただきました。 そのまま疑問に思っていることを聞けばいいですよ。英語で、メールリンクもあるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12732-10 - 2024/12/17 (火) 00:51:28 - おお >[Re:5] 舞子さんは書きました : > >[Re:4] おおさんは書きました : > > 多分接着細胞と思われますが > 多少は入っているでしょう。本当に上澄みでいいのであれば遠心後のペレットは使わないのでは。 > > マイコプラズマの回収のための遠心でしょう。

(無題) 削除/引用 No.12732-9 - 2024/12/17 (火) 00:50:20 - MM > 培養上清を遠心したペレットを使うのですか？細胞除去、フィルターろ過も済ませたものを使うのですか？ kitについているプロトコールは、「1 ml of cell culture supernatant」を遠心後、上清を除いて50μL以下にし、PBSで懸濁した液をサンプルとしてPCRする、とあります。底にペレットができている図がついてます。 「Note: The pellet will be invisible except if some cells have been collected. Importantly, their presence will not affect the detection assay.」 とあり、見えないかもしれないけれど何らかの沈殿物を懸濁してPCRにかけているような表現に見えるのですが… 測定したいサンプルはすでに細胞除去してフィルターろ過し、液体だけにしたものです。 多少の細胞片が入っているような状態でないと、マイコのDNAが混じってこず偽陰性になってしまうということはないでしょうか。 海外メーカーのkitなのでどう質問していいのかわからずこちらを頼らせていただきました。

(無題) 削除/引用 No.12732-8 - 2024/12/17 (火) 00:49:45 - おお >[Re:6] MMさんは書きました : > ありがとうございます。 > 細胞は接着細胞ですが製品は培養上清で、conditioned mediumです。 > 最終製品からサンプリングして試験サンプルとするので、細胞除去、フィルターろ過も済ませたものになるのですが、それだと検査の意味がなくなってしまうのかな？と疑問に思った次第です。 0.2とか0.4um のフィルターだとマイコプラズマは素通りします。

(無題) 削除/引用 No.12732-7 - 2024/12/16 (月) 14:11:23 - 舞子 >[Re:1] MMさんは書きました : > 培養上清が試験サンプルで、1mLの培養上清を14,000xgで遠心したペレットを使用して等温PCRを行うとなっています。 >[Re:6] MMさんは書きました : > 細胞は接着細胞ですが製品は培養上清で、conditioned mediumです。 > 最終製品からサンプリングして試験サンプルとするので、細胞除去、フィルターろ過も済ませたものになるのですが、それだと検査の意味がなくなってしまうのかな？と疑問に思った次第です。 培養上清を遠心したペレットを使うのですか？細胞除去、フィルターろ過も済ませたものを使うのですか？ 疑問に思うのであればそのキットの会社に聞いた方がいいと思います。キットのプロトコールにも何を測定しているのか原理が載っていると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12732-6 - 2024/12/16 (月) 13:24:51 - MM ありがとうございます。 細胞は接着細胞ですが製品は培養上清で、conditioned mediumです。 最終製品からサンプリングして試験サンプルとするので、細胞除去、フィルターろ過も済ませたものになるのですが、それだと検査の意味がなくなってしまうのかな？と疑問に思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.12732-5 - 2024/12/16 (月) 04:59:31 - 舞子 >[Re:4] おおさんは書きました : > 多分接着細胞と思われますが 多少は入っているでしょう。本当に上澄みでいいのであれば遠心後のペレットは使わないのでは。

(無題) 削除/引用 No.12732-4 - 2024/12/16 (月) 04:49:46 - おお 多分接着細胞と思われますが

(無題) 削除/引用 No.12732-3 - 2024/12/16 (月) 00:44:03 - 舞子 > 1mLの培養上清を14,000xgで遠心したペレットを使用して等温PCRを行うとなっています。マイコプラズマは細胞内寄生するので、細胞を取ってきてLysisしないでいいのでしょうか。培養上清で陰性で、マイコプラズマは否定できるのでしょうか。 遠心後のペレットを使っているので培地の上澄みではなくて細胞が入っていますね。

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