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(無題) 削除/引用 No.12729-6 - 2024/12/15 (日) 18:10:37 - おお >[Re:4] G25さんは書きました : > TOPO cloningはnon-recombinantがほとんど出ないはずですが。 > side-by-sideでインサートなしのnegative controlを見れば、non-recombinantのバックグラウンドレベルがわかりますね。「コロニーが多数」にはならないはず。 > primer dimerのような小分子二重鎖DNAかなにかが入ってるのかも。 あ、そうですね｡からばかりのコロニーが増えるというのは妙ですねぇ。。。 一応ゲル切り出ししているようですから、200bpぐらいのものはノンスペでPCRがうまく行ってないのかも｡コロニーを懸濁したのと直接pcr反応溶液に入れたので顕著に結果が違うというのも変だし。やはり数個ミニプレップした方がいいかも｡

(無題) 削除/引用 No.12729-5 - 2024/12/15 (日) 05:59:48 - oyaji pZeroなど、IPTGで選択が効くplasmidではPCR screeningより、とりあえず４つ拾い、mini-prepするのが妥当です。PCRの増幅がうまくいっているなら、８０％程度は入っているはず。４つ拾えば、ほぼ確実に組み換え体が得られる。 colony PCR screeningは、滅菌した爪楊枝で拾い、そのままPCR溶液に数回浸し、その後、LBに浸けてミニプレップしてます。 小生のところでは、TOPOより、タカラのリガーゼ使った方がライゲーションは上手くいってます。TOPOで増やしたplasmidを適当な酵素（EcoRIだったかな？）で切断し、リガーゼでライゲーション。transformして、出てきたコロニーを増やし、EcoRVで切断すれば、いくらでもサブクローニングに使えます。

(無題) 削除/引用 No.12729-4 - 2024/12/13 (金) 16:27:01 - G25 TOPO cloningはnon-recombinantがほとんど出ないはずですが。 side-by-sideでインサートなしのnegative controlを見れば、non-recombinantのバックグラウンドレベルがわかりますね。「コロニーが多数」にはならないはず。 primer dimerのような小分子二重鎖DNAかなにかが入ってるのかも。

(無題) 削除/引用 No.12729-3 - 2024/12/13 (金) 14:42:42 - たなか おお さま コメントありがとうございます。サンプルはKODでPCRをしたのちに切り出し・精製をしたものとなります（40 ng / ulほどの濃度です）。 本日、菌液を作らずにコロニーをつついたチップ先を用いて直接PCRチューブ内でピペッティングしてみましたところ、200 bpほどのところにバンドが確認できました。おそらく何も入っていないということなのでライゲーションからやり直してみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12729-2 - 2024/12/12 (木) 23:03:02 - おお 原因究明も必要なのかもしれませんが、とりあえず数コロニーをミニプレップして制限酵素を浸かってインサートを確認してみてください。 コロニーピックアップはかなり適当でもいいと思ってます｡元々の方法論としても雑なやりかたですし。 からのベクターなどがたくさん拾えてきたのであれば、200bpあたりにバンドが出ると思われますが、そう言うのも検出できませんか？ KODで増やしたアンプリコンはゲルから切り出してますでしょうか？

TOPOを用いたクローニングにつきまして 削除/引用 No.12729-1 - 2024/12/12 (木) 15:45:39 - たなか 初めて質問させていただきます。 KODによるPCRによって751 bpの遺伝子を増やしたのち、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを用いてライゲーションを行いました。このサンプルについてOne Shot Top10のコンピテントセルを用いて形質転換を行い、37℃で１晩インキュベーションし、翌日コロニーが多数できていることが確認できました。 その後、目的の遺伝子がクローニングできているかを確認するためにコロニーPCRを行いました。チップ先でコロニーをつつき、20 ulのMiliQ中でピペッティングしたのち、この菌液を1 ulとってGoTaqでPCRしました (GoTaq: 5 ul, M13F: 0.2 ul, M13R: 0.2 ul, MiliQ: 4.6 ul) ところ、何もバンドが見られませんでした。 なにも増えてきていないということなのですが、つまりコロニーピックに失敗しているということなのでしょうか。TOPOにはLacZのシステムがなく、青白スクリーニングができないのですが、コロニーをピックする際になにかコツがいるのでしょうか。TOPO以外のベクター (pGEM-T)・x-gal, IPTGを用いた青白スクリーニングをするときは同様の方法でうまくいくのですが...。 どなたか同様の製品を用いてクローニングしている方がおられましたら、解決策をご教示いただけますと幸いです。 以上、よろしくお願いいたします。

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