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(無題) 削除/引用 No.12719-14 - 2024/12/14 (土) 18:40:01 - 2 その5KDaの分子は当該タンパク質の中の特定の部位ただ1箇所に結合するものという理解で良いですか？その前提で言うと、そうした高分子量のタンパク質の5KDaのズレを電気泳動で識別するのは容易でないと思われますし、5KDaの分子が付加したから５KDa分ずれが目視でわかるかと言われると、正直SDS-PAGEはそこまで精度の高い分析法ではないように思います。またユビキチンやその仲間の低分子量タンパク質の修飾体などをWesternなどで観察していると、修飾formは必ずしも計算上の分子量通りの異動度でないことも少なくないです。

(無題) 削除/引用 No.12719-13 - 2024/12/13 (金) 06:04:28 - おお TAEのSDSPAGEのゲルバッファーのレシピは探せばあるかなと思ったんだけどありませんね。DNAと同じレシピでアガロースで蛋白を流しているケースも有るようなので、一緒でいいのかもしれないですけど、、、 ちょっとバッファーのpHなどを変えたりするだけでも蛋白の挙動とか大きく変わったりしますしいじってみるのもありなのかもしれないですけど。 Bis-TrisゲルでMOPSとMESの泳動バッファーでもかなり違うし、MOPSは高分子の分解能がいい。多分レシピは好評されているんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.12719-12 - 2024/12/13 (金) 05:48:24 - おお >[Re:10] 2さんは書きました : > スメアになったことはないですが、泳動時間が長くなるので多少横方向への拡散はあるかもしれません。 そうですか、私が経験したのは極端な例だったのかもしれません。だからあまりBPBが流れきってから長く泳動するのは控えてます。 >低濃度ゲルでも良いと思いますが、脆弱になり扱いにくいようなことが書いてあったのと、高分子量といっても150-200KDaくらいなら、 > むしろ高分子量タンパク質ではwesternの際に転写がしばしば不十分になることが問題点としてあります。特にセミドライのように長時間の転写が難しい場合。 扱いにくいのはわかりますが、Transferが問題になることを考えると私はどうしても可能な範囲で下げたくなります。６％で１.５mm厚なら個人的にはそんなに扱いにくくありませんし、やりにくいなら６.５％とかちょっと上げるだけでもましになったりしますので扱える範囲で下げたほうがいいかなと。 というのが個人的な意見です。

(無題) 削除/引用 No.12719-11 - 2024/12/12 (木) 18:45:59 - s ご返信が遅くなり申し訳ありません．様々なご回答，ありがとうございます． 詳しくは申し上げられませんが，タンパク質に約5kDaの分子を化学修飾し，その修飾ができたかどうかの判定をするために電気泳動を試しておりました． 未修飾タンパク質のバンド（約150kDa）と，修飾分子がタンパク質と一対一結合した結果としてのバンド（約155kDa）を識別したかった，という意図になります． GPCは所有カラムの問題で難しく，また蛍光標識なども修飾したい5kDaの分子の特性上困難，ということで，最近電気泳動を始めた次第です． 着色マーカーの様子を見ながら100kDa辺りまで流しきったりする，というのは手元にあるものだけですぐに試せそうなので，早速取りかかっているところです． また，ラップを使えば柔らかいゲルのハンドリングが良い，というのも参考になりました． その他，教えていただいた製品についても検討してみます．

(無題) 削除/引用 No.12719-10 - 2024/12/11 (水) 20:17:33 - 2 スメアになったことはないですが、泳動時間が長くなるので多少横方向への拡散はあるかもしれません。ただそれも許容範囲で、特に変になるというほどではありません。低濃度ゲルでも良いと思いますが、脆弱になり扱いにくいようなことが書いてあったのと、高分子量といっても150-200KDaくらいなら、そこまでしなくても、通常濃度でも十分対応可能ではと。 むしろ高分子量タンパク質ではwesternの際に転写がしばしば不十分になることが問題点としてあります。特にセミドライのように長時間の転写が難しい場合。

(無題) 削除/引用 No.12719-9 - 2024/12/11 (水) 15:55:25 - おお >[Re:8] 2さんは書きました : > 普通に8% gelで泳動して、フロントライン（BPBの青い色素のライン）がゲルから流れ出ても構わないので、泳動を続けて有色分子量マーカー（どこのメーカーも高分子量のマーカータンパク質は着色が薄いことが多いので、少し多めにアプライしたほうがいいです）を見ながら、見たいものが十分分離できているくらいになったら止めれば150ー200KDaくらいなら十分綺麗に分離することは可能です。 流しすぎるとスメアになっっりしませんか？私がそれやるなら、6％ぐらいにしてあまり流す時間をのばさないようにするかもしれません。 >高分子量〜低分子量まで全部みたい 、かつ、 150KDaもみたい、ということでしたら、市販のグラジェントゲル使うか、ゲル濃度を変えて２回電気泳動するかどちらかと思います。 ここでどなたか、10％を下に作りその上にやらかいゲルを重そうすると言うやり方を教えてもらった事が有ります｡

(無題) 削除/引用 No.12719-8 - 2024/12/11 (水) 12:09:25 - 2 普通に8% gelで泳動して、フロントライン（BPBの青い色素のライン）がゲルから流れ出ても構わないので、泳動を続けて有色分子量マーカー（どこのメーカーも高分子量のマーカータンパク質は着色が薄いことが多いので、少し多めにアプライしたほうがいいです）を見ながら、見たいものが十分分離できているくらいになったら止めれば150ー200KDaくらいなら十分綺麗に分離することは可能です。そんな感じで200KDaくらいのタンパク質は普通に分析してます。高分子量〜低分子量まで全部みたい 、かつ、 150KDaもみたい、ということでしたら、市販のグラジェントゲル使うか、ゲル濃度を変えて２回電気泳動するかどちらかと思います。

(無題) 削除/引用 No.12719-7 - 2024/12/11 (水) 11:17:24 - ぺんさん ナカライテスクにWIDE RANGEゲル調製用緩衝液というのがあります。 自作ゲルのバッファーだけをこれに変えるのですが、 高分子量の分離が少し良くなります。 更に、ゲルの強度が上がるので取り扱いが容易になります。 マニュアルには、6%ゲルの組成がありました。 やわらかいゲルの取り扱いですが、 ゲル板を片方外した後に、ゲルの上にラップを置きます。 ラップに貼り付けるように板からはがすときれいに剥がれます。 ラップごとゲルをトレーに入れてそのまま染色します。 トレーから出すときはまた、新しいラップをゲルに貼り付けるとうまくいきます。 いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12719-6 - 2024/12/11 (水) 08:34:38 - 独り言 普通のミニゲルサイズではなく、 ミニゲルサイズの2倍の高さがあるゲルを作るとか。 使ったことはないけど。 http://www.nihon-eido.jp/newarrival/

(無題) 削除/引用 No.12719-5 - 2024/12/11 (水) 08:11:45 - おお 等電点電気泳動で分けてみるのも手かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.12719-4 - 2024/12/11 (水) 07:37:29 - アンプ ゲル作製をその上で行うことでポリアクリルアミドと共有結合する透明なシートがありますので、柔らかいゲルのハンドリングに役立つのではないでしょうか。 www.cosmobio.co.jp/product/detail/gelfix-netfix-supporting-film-ser.asp?entry_id=15375

(無題) 削除/引用 No.12719-3 - 2024/12/11 (水) 06:08:57 - おお tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp33400.pdf こんなのがあるよ。 www.lonzabio.jp/catalog/pdf/pd/PD014.pdf アガロースだけを使う方法も。 7% MetaPhorXR agaroseで 4%–20% SDS polyacrylamideに近い泳動パターンが得られるようです。２番目のリンクでは１００から３００kDaレンジは３％ぐらいと書かれてますね。 www.tandfonline.com/doi/epdf/10.2144/98244pf01?needAccess=true あまり変えたくないというのならゲルの厚みを厚くすると扱いやすくはなります。もし試されてなかったら１．５mm厚のゲルにしてみてもいいかもしれません。２mmがつくれるならそれでもいいかも。

(無題) 削除/引用 No.12719-2 - 2024/12/10 (火) 21:10:50 - qq ＞普段は7.5%でSDS-PAGEをやっており， あれまあ、普段が薄いゲルなのでしょうかね？それでは不十分ということでしょうか。 想像ですが、それほど高電圧にしないで長く泳動して、100kDa辺りまで流し切ったりすると良いのではないでしょうか？ 途中で泳動バッファーを交換するほうが良いかもしれません。 150kDaと155kDaのタンパクを分離したいということと、それぞれの分子量の順番に出てくるということは「別の話」なので、あまり拘泥しないほうが良いと思います。

高分子量タンパク質の電気泳動 削除/引用 No.12719-1 - 2024/12/10 (火) 19:04:31 - s お世話になります． 比較的高分子量のタンパク質を高解像度で分離したいのですが，PAAmゲルの網目を緩くする（濃度を下げる）以外に何か良い方法はありますでしょうか． 普段は7.5%でSDS-PAGEをやっており，その条件では66kDaと70kDaが綺麗に分離できます． これから150kDaと155kDaの分離を試したく，PAAmゲルを5%まで下げてみましたが，ゲルが柔らかすぎてハンドリングが難しく困っております． ・thermo fisherのページに，Tris-Acetate Gelを用いたTris-Acetate SDS Running BufferでのSDS-PAGEというものがありました． 既製品ではなく自作されている方がいらっしゃれば組成を教えて頂きたいです． ・PAGEのゲル濃度を下げた代わりにアガロースで補強してハンドリングをよくするという話も聞いたことがあるのですが，試したことのある方はいらっしゃいますか． そのほか，何か良さそうな方法がございましたらご教示いただけますと幸いです． どうぞよろしくお願いいたします．

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