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(無題) 削除/引用 No.12716-5 - 2024/12/12 (木) 13:01:14 - え 橘さん、ご回答ありがとうございます。 >サンガーで読むときにクローニングしているなら、試しにダイレクトでも読んでみた方が良いでしょう。 また、PCRの増幅エラーの可能性もなくはないので、酵素やプライマーを変えてやってみるのも良いかもしれません。 データ解析で間違えている可能性もあるので、別のソフト使ったり別の方にやってみてもらうのも良いでしょう(どんな間違いをすればそうなるのか疑問なので可能性は低いと思いますが)。 クローニングは行っておらず、増幅したPCR産物をサンガーシーケンシングで読みました。また、酵素を変えてのサンガーシーケンシングも行いましたが同様に変異は検出されませんでした。また、データ解析についてもfastp->bwa-mem->gatkによるBQSRありの異なるパイプラインで再び行いましたが、同様のSNPが同一のリード深度で検出されました。 >それでも同じ結果なら、サンプルの取り違えの可能性が最も高い気がします wgsを行った変異体ゲノムについて、おそらくその可能性が高いです。サンガーシーケンシングに用いたゲノムについては,変異体のみ枯死する処理をおこなってからゲノム抽出を行ったことを確認しているため、その可能性は低いと考えております。 再び確実なゲノムを用いてwgsを行おうと考えております。

(無題) 削除/引用 No.12716-4 - 2024/12/12 (木) 12:43:01 - え >シロイヌナズナは全くやったことがない素人なので、書く資格もないかと思ってましたが、どなたも書かれないので。シロイヌナズナはゲノムサイズが小さいので、150bpペアエンドで23倍のカバレッジなら、大体良さそうではありますが、適切なアッセンブルツールを選択されていても場所によってはアッセンブルを間違えることもあります。 サンガーで読んだPCRフラグメントが正しく狙った箇所か、というのもありますが、そちらでは十分長いところを読まれてるのであれば、それよりは、ショートリードのアッセンブルのほうが気にはなります。やはりロングリードで検討された方がよろしいのでは？ ご回答ありがとうございます。 今回はde novo アセンブリではなく、レファレンスゲノムへのマッピングを行っておりました。 構造変異の疑いを否定しきれないため、ロングリードや構造変異を検出するソフトウェアの使用を検討中です。

(無題) 削除/引用 No.12716-3 - 2024/12/10 (火) 02:27:37 - 橘 シロイヌナズナならde novoアセンブルではなく既知ゲノムへのマッピングをしているのでは？ なのでアセンブルミスは考えなくて良い気がしますが。 de novoアセンブルしているなら別ですが。 Illuminaだと「ものすごく起きやすい読み間違い」は実際ありますが、100%間違えるパターンは見たことがないです(カバレッジをどれだけ上げても読まれない領域、ならよくある)。 なので20xの領域で全リードで間違えるというのは考えにくいですね。 サンガーで読むときにクローニングしているなら、試しにダイレクトでも読んでみた方が良いでしょう。 また、PCRの増幅エラーの可能性もなくはないので、酵素やプライマーを変えてやってみるのも良いかもしれません。 データ解析で間違えている可能性もあるので、別のソフト使ったり別の方にやってみてもらうのも良いでしょう(どんな間違いをすればそうなるのか疑問なので可能性は低いと思いますが)。 それでも同じ結果なら、サンプルの取り違えの可能性が最も高い気がしますが、Illuminaかサンガーのどちらかで100%読み間違える領域、ということであれば論文として報告すべきかもしれません。 もし既知なら、シロイヌナズナならチューリッヒの方とかその関係者に訊けばわかるはずです。

(無題) 削除/引用 No.12716-2 - 2024/12/07 (土) 16:20:48 - toto シロイヌナズナは全くやったことがない素人なので、書く資格もないかと思ってましたが、どなたも書かれないので。シロイヌナズナはゲノムサイズが小さいので、150bpペアエンドで23倍のカバレッジなら、大体良さそうではありますが、適切なアッセンブルツールを選択されていても場所によってはアッセンブルを間違えることもあります。 サンガーで読んだPCRフラグメントが正しく狙った箇所か、というのもありますが、そちらでは十分長いところを読まれてるのであれば、それよりは、ショートリードのアッセンブルのほうが気にはなります。やはりロングリードで検討された方がよろしいのでは？

illuminaのショートリードシーケンスの偽陽性率について 削除/引用 No.12716-1 - 2024/12/05 (木) 17:47:59 - え お世話になります。 シロイヌナズナ変異体の原因遺伝子の同定のために、Illminaの150bpペアエンドでカバレッジ23倍のWGSを行いました。その後CLC genomics workbenchによる変異解析を行い、リード数が20前後ですべてのリードが変異型としてcallされているsnpを見つけました。しかし、当該領域にサンガーシーケンシングを行ったところ、変異が全くコールされませんでした。 リード深度がある程度深い状態でのIllminaのショートリードシーケンスの結果とサンガーシーケンシングの結果の不一致はよく起きるものなのでしょうか。また、それを防ぐための対策などはあるのでしょうか。 どうぞよろしくお願いいたします。

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