全22件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.12711-22 - 2024/12/06 (金) 06:26:09 - oyaji プレートは４度保存。 ampは水溶解ストックを−２０度保存（冷凍庫、温度チェック必要かも、家庭用の物は−２０度まで行かないことも）。頻用するので、一部は４度保存。 ・・・ここまでは”よくある話”かと、、。 amp選択がうまく行かないときは、コンピタント等を使い、MIC濃度をチェックします。例：35mm　dishで多数のプレート作成し、抗生剤なし、本来の濃度（普通のストックだと2μl）、５０％アップ、１００％アップ、、、。・・・こんな感じでMICをチェックし、「確実にコンピタントが死滅する濃度、かつ、amp 耐性のplasmidを含む大腸菌が増殖する濃度」を決めてやってます。amp濃度は研究室によって、結構違います。（理由は不明） 抗生剤の濃度が少ないと、長時間インキュベーションの場合、カラの大腸菌が増殖し、ミニプレップでplasmidがゼロになります。（これショックです） plasmidによっては、通常のamp濃度では増殖しない場合も経験してます。その時は逆に半分にしたり、、、。本来、ペニシリン系は治療係数が大きいので、多めに入れても大丈夫なはずですが、、、。 LBは”出来合い”ではなく、各成分を計測して作成。（これも時々影響します。出来合いのLB等は長期保存できないようです。）

(無題) 削除/引用 No.12711-21 - 2024/12/06 (金) 04:04:55 - おお >[Re:18] カナカナさんは書きました : > > 経験的にはカナマイシンの方が室温でヘタりやすいイメージ > > カナマイシン硫酸塩はオートクレーブしても抗菌作用を維持できたはずだけど。。 むかし粉末の人などの細胞で使う培地でカナマイシンが入っていて溶かしてオートクレーブをかけれるものを使ってました。 へたるのはそのボトルにあったカナマイシンがすでに悪くなっているのでは、質問者と同じような感じで。

(無題) 削除/引用 No.12711-20 - 2024/12/04 (水) 18:36:57 - おお >[Re:16] かさんは書きました : > 37℃でカビが生えることはないというか乾燥でカラカラになる方が早い 既に指摘があるように真核生物には効かないので判断基準にはならない｡ > > 経験的にはカナマイシンの方が室温でヘタりやすいイメージ > アンプだと２晩37℃だとアタリの周りにサテライトが大きくなってくるけど > カナマイシンは2晩で1晩で確認できた所と別の場所にコロニーが生えてくる これも酵母類じゃないかな。へったっているならアンプのようにサテライト状になるはず。加えている抗生物質が酵母やカビなどに効かないのに無菌操作をおろそかにしてもそんなに変にならないのは、大腸菌の方がかなり増殖のスピードが速く、酵母が生える前に実験が終わっているから｡ 因みに酵母の培養で大腸菌などのコンタミを防ぐためにカナマイシンを加えておくこともある。 カルベニシリンはアンプより安定なイメージはあるがアンプと比べてかなり高価らしい。多くの人がアンプで十分と言っているようです。

(無題) 削除/引用 No.12711-19 - 2024/12/04 (水) 17:59:19 - 774R 物質としてはKanの方が丈夫ですね。 経験的に、AmpよりKanの方が「安全域」が狭い。 故に、Kanは大過剰に加えられないからヘタリを感じやすい面はあるかと思う。

(無題) 削除/引用 No.12711-18 - 2024/12/04 (水) 17:52:19 - カナカナ > 経験的にはカナマイシンの方が室温でヘタりやすいイメージ カナマイシン硫酸塩はオートクレーブしても抗菌作用を維持できたはずだけど。。

(無題) 削除/引用 No.12711-17 - 2024/12/04 (水) 17:20:00 - 774R ＞外でフタをパカパカあけてカビが生えるか見ればいいのでは Ampが効いててもカビは生えますよ？

(無題) 削除/引用 No.12711-16 - 2024/12/04 (水) 17:04:39 - か 怪しいのは大元の粉末で、高い物じゃないんだし新品を同様の操作で解決すると思う。 失活疑うなら今のプレートを 外でフタをパカパカあけてカビが生えるか見ればいいのでは 正しくAmpが効いてるLBプレートなら無菌操作でなくても（ベンチはもちろんバーナーすらなしでも） 37℃でカビが生えることはないというか乾燥でカラカラになる方が早い 経験的にはカナマイシンの方が室温でヘタりやすいイメージ アンプだと２晩37℃だとアタリの周りにサテライトが大きくなってくるけど カナマイシンは2晩で1晩で確認できた所と別の場所にコロニーが生えてくる わざわざプラスミド入ってるかは確認してないけど

(無題) 削除/引用 No.12711-15 - 2024/12/04 (水) 16:51:44 - Amp 4°Cで2ヶ月ほど保管したAmpプレートを使ったときに、オーバーナイトのインキュベーションでサテライトコロニーがはっきりと出たことがあります。びちゃびちゃに生えるくらいまで失活するまでに、サテライトがガッツリ出る段階を経ると思うのですが、5日目くらいまではきちんとセレクションできているという質問者さんの状況はどうだったのか（サテライト出まくり？）気になります。 私はアンプさん（紛らわしい名前で失礼）の疑問に同意できます。

(無題) 削除/引用 No.12711-14 - 2024/12/04 (水) 16:36:19 - おお >[Re:12] アンプさんは書きました : > 粉末の状態で劣化していたとしても、作成5日めに"きちんと"選択が掛かっていたものが、わずか一週間後に"びちゃびちゃに生える"までになるものでしょうか。 > 私がお示ししたのは事例ではそんな感じでした。

(無題) 削除/引用 No.12711-13 - 2024/12/04 (水) 15:37:04 - G25 >粉末の状態で劣化していたとしても、作成5日めに"きちんと"選択が掛かっていたものが、わずか一週間後に"びちゃびちゃに生える"までになるものでしょうか。 ありえます。 私が経験したときもそんな感じでした。 こういうふうに想像するのですが、 劣化しているけれどぎりぎり力価が残っている状態で培地作成直後は効いていた。しかし、保存中に経時的な劣化が進んで有効濃度のラインを下回った。おそらく、作成直後に非耐性菌をまいたときは生えてこなくても、さらに、そのままおいておくと生えてくるのでしょう。 普通の適用濃度は必要最低限の何倍か何十倍か、"安全係数”じゃないですがある程度過剰なので保存中少々劣化しても十分効いているのでしょう。しかし、もともと劣化していると少々の劣化で効力がなくなるレベルに達してしまうのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12711-12 - 2024/12/04 (水) 14:20:43 - アンプ 粉末の状態で劣化していたとしても、作成5日めに"きちんと"選択が掛かっていたものが、わずか一週間後に"びちゃびちゃに生える"までになるものでしょうか。 原因がアンピシリン粉末自体にあるかどうかを確認するために、ご近所のラボから少量分けてもらって同じ操作を試してみることはできませんか。

(無題) 削除/引用 No.12711-11 - 2024/12/04 (水) 13:53:24 - おお むかし爆買いしたアンピシリンをほぼ１０年ぐらいかけて使っているラボがいて、アンピシリンが効かなくなってきたということがあります。古くなってませんか？ また１０年とかそんなに古くなっていなくても試薬のボトルの粉末が湿気てくるともしかしたら寿命が短くなってくるかもしれません。たとえば粉末は４度とかー２０度で保存していて、とりだして容器が冷たい状態で蓋を開けると湿気てきます。だから室温に戻してから蓋を開けて粉末をとるのがたいていだと思います。ただ、これは試薬を最初に作るときに教えてもらう基本ですので、言及するまでもなかったかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.12711-10 - 2024/12/04 (水) 12:47:34 - G25 粉末が保存中にイカれることはあります。 最近の製品は品質が良いのでメーカーの指示に従って保存していれば問題ないと思いますが。 LBの調製はどのように？　NaOHでpHを7.5（少なくとも7.0以上）にしていますか。普通に材料を溶かしただけだとpHが低くてアンピシリンの効きが悪くなることがあります。カルベニシリンは低pHでも効くという利点がありますが、アンピシリンに比べて大変に高価です。それだけのことでカルベニシリンを使うのは合理的でない。

(無題) 削除/引用 No.12711-9 - 2024/12/04 (水) 12:22:04 - 774R コロニーの状態でなく全面に生えてくるということですか。 それはアンピシリンがヘタってますね。 他の方の指摘の通り、粉末の段階でダメになってるか、-20℃での保存でダメになってるかでしょうね。 凍結しないのも不思議ですが、わざと50%くらいのエタノール溶液で100mg/mlストックを作る流儀もあるので、それかもしれませんね。凍ることもあるなら50%より低いと思いますが。溶かす手間が省けて便利です。 トラブルシューティングをするなら試しに、加えるアンピシリンの量を5倍や10倍にして持ちを見てみたらどうでしょう？それで改善するならストックが弱ってたということで。 培地を作ってから壊れるのであれば、濃く作っても寿命が多少伸びる程度ですから区別はつきます。

(無題) 削除/引用 No.12711-8 - 2024/12/04 (水) 11:48:41 - おおさか 774Rさん 形質転換させた大腸菌のみではなく、形質転換できていない大腸菌（プラスミドを取り込んでいない大腸菌）も生えるという状況です。コロニーは確認できず、培地全体にべちゃべちゃに生えています。 totoさん 古い粉末を使っているので可能性はあるかもしれません…。 指導教員に相談してみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12711-7 - 2024/12/04 (水) 11:48:11 - Amp アンピシリンは熱と酸性に弱いと聞いたことがあります。 普通にLBを作製して極端にpHがずれることはないと思いますが、念の為確認してみても良いかもしれません。 どうしても保存中に失活してしまうのであれば、抗生物質なしのLBプレートを作っておいて使う直前にアンピシリンを塗り拡げるというやり方にしたらどうでしょう？

(無題) 削除/引用 No.12711-6 - 2024/12/04 (水) 11:33:00 - toto 溶液ではなく粉末の保存に問題があったとしか思えないですね。今後のことを考えると、カルベニシリンを買うよりもアンピシリン粉末を買い直した方がいいような気がします。それにしても粉末でそんなに不安定なこともないので、不思議な話ではあります。

(無題) 削除/引用 No.12711-5 - 2024/12/04 (水) 11:26:24 - 774R ＞形質転換させたコンピを蒔いても全くセレクションがかかっておらす、 形質転換させたコンピは生えるんじゃないですかね？

(無題) 削除/引用 No.12711-4 - 2024/12/04 (水) 11:04:26 - おおさか 独り言さん はい、インキュベートは37℃でO/N(16時間以下)にしています。 カルベニシリン検討してみます。ありがとうございます。 アンプさん はい、作成直後はかかっています。私の感覚だと作成後5日目くらいまではきちんとセレクションできているようです…。 濃度は100mg/mLで作成したアンピシリンを培地200mLに対して200uL添加しています。

(無題) 削除/引用 No.12711-3 - 2024/12/04 (水) 10:55:49 - アンプ 作成直後はきちんと選択が掛かってるのですよね？ また、濃度はどのくらいになるように加えていますか？

全22件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---