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(無題) 削除/引用 No.12710-8 - 2024/12/06 (金) 17:00:59 - 水滴 おお さん ありがとうございます！ そのようにされているんですね。それでやってみようと思います！ 本当にありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.12710-7 - 2024/12/05 (木) 15:37:24 - おお >[Re:6] 水滴さんは書きました : > おお さん > ・均一に底に沈むようにする > →教えていだたいた方法でやってみようと思います。 > 細胞が沈む頃というのは、時間や目視での観察の基準などありますでしょうか？ > 顕微鏡で覗いて、いくらかの細胞が接着してきた頃とかでしょうか？ 細胞が接着しだしたのを剥がすのは細胞にあまり良くないような気がしますのでそれより前にやってます。 当たり前のことしか言えませんが顕微鏡で見て底にフォーカスに合わせたとき、ピントが合わない浮いている細胞がほとんどない感じの状態。この状態でなるべくまきあがらないように均一にするという感じです。

(無題) 削除/引用 No.12710-6 - 2024/12/05 (木) 14:10:29 - 水滴 おお さん 返信くださりありがとうございます ・血清のロットが違うのでは？ →非働化した血清を使用しています。実験回毎でおそらく異なるロットの血清を使用している状態です。ですので、血清が変わることで増殖スピードが僅かに変わっている可能性はあるかもしれません。 ・均一に底に沈むようにする →教えていだたいた方法でやってみようと思います。 細胞が沈む頃というのは、時間や目視での観察の基準などありますでしょうか？ 顕微鏡で覗いて、いくらかの細胞が接着してきた頃とかでしょうか？ ・n数を増やす →元々の実験がかなり群わけが多い実験なので（20群とか）、できれば最後の手段に、と考えております。 丁寧にご回答してくださりありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12710-5 - 2024/12/04 (水) 03:31:37 - おお >[Re:4] 水滴さんは書きました : 極力以前の条件で続けたいということですね。 血清のロットが変わっているとかありませんか？そのため微妙に増殖が速くなっているとか（血清を使っているのなら）。あまりいい解決方法ではないかもしれませんが、若干血清濃度を下げるとか５から７％とか、非動化するとか、、、 結局条件変えているじゃないかと言われるかもしれませんが、、、 > > 私も細胞の密度は原因の一つと考えています。 > 2日目のウイルス添加時では、中央に細胞が寄っている傾向がみられているので、おそらく中央の方が密度が高くなっていると思われます。 > > 細胞が中心に寄りにくくするために、 > ・インキュベーターに持っていく間、極力揺らさない > ・plateを大きく八の字に動かす 静置しておけば真ん中による傾向はあります。 ほんとに慎重に均一にしたいときは、細胞懸濁液（あらかじめからのWellにその懸濁液を加えれば目的の密度になるように調製した）を加えてインキュベーターにいれて細胞が底に沈む頃（接着するまえ、１、２分でしょうか）に前後にゆらす、左右にゆらすを繰り返し、あるいは前後左右の面をちょっと傾けながら叩いたりしてます。これを何回か繰り返すようにしてます。そこに沈んでいる状態で均一になれば、接着までの時間が短いだろうからインキュベーターにいれて放置するよりいいかなと思ってます。 またそこに沈む時間を短縮するために懸濁液の液量を減らすのも有効かと思ってます。その場合端による可能性もありますが、均一の状態で底に沈んてくれるように上記の操作をすれば同様に対処できるでしょう。 > > > プレートにコーティングをしたことがないので、分からないのですが、そのコーティングを施すと、死細胞が剥がれにくいなどはありますでしょうか？ 死細胞がくっついているのは見たことがありますね。。。ずっとくっついたままかわからないですけど。生死判別ができる色素を使うというのもあるかもしれませんが、、、まあ以前の実験と色々と変わっているわけで、抵抗があると言われればそうですよねと言うしかないです。 もう一つ思いつくのはWellの数を稼いで（n＝６とか１０とか？）剥がれたものはアッセイできないとして除いてデーターを取るとか、、、

(無題) 削除/引用 No.12710-4 - 2024/12/03 (火) 23:24:02 - 水滴 おお さん ありがとうございます。 私も細胞の密度は原因の一つと考えています。 2日目のウイルス添加時では、中央に細胞が寄っている傾向がみられているので、おそらく中央の方が密度が高くなっていると思われます。 細胞が中心に寄りにくくするために、 ・インキュベーターに持っていく間、極力揺らさない ・plateを大きく八の字に動かす というようなこともしてみたりしたのですが、あまり変わらなかった印象があります… 観察期間についてですが、絶対に7日間でなければいけないわけではありません。 ですが、今までの実験をその日数で行っていたため、比較がしやすいという利点があります。また、ウイルスが十分に細胞内で増殖し、細胞が死ぬまでに日数がかかります。ウイルス添加後3日（5日目）よりも、ウイルス添加後5日後（7日目）の方が、死細胞率が変わるため、異なるウイルス濃度で差が見えやすいという点もあります。 ウイルス添加後5日、7日目を超えてインキュベートしてもあまり差は開きにくいので、おそらくこの日数が最短かつ差が見えやすい日数なのではと考えています。 これらの点から、できれば観察期間は変えたくないと考えています。 プレートにコーティングをしたことがないので、分からないのですが、そのコーティングを施すと、死細胞が剥がれにくいなどはありますでしょうか？ 私が行っている実験は、死細胞が剥がれて浮いてくるため、それをwashで除去して、生細胞のみにした状態で染色することで生細胞率を目視で見る、というものになりますので、死細胞がはりついたままだとやりづらいな、と感じます。

(無題) 削除/引用 No.12710-3 - 2024/12/03 (火) 03:50:38 - おお あ、さいごまでよんでなかった。オーバーコンフという点では意識しているのですね、、、でも密度的に偏りがあり密度が高いところで剥がれやすいという感じですか？それならやはり密度と関係しているのかもしれませんね。密度的には撒き方の工夫が必要かもしれませんが、完璧に均一になるというのは難しいのかもしれません（プレートを回さないとかいくらかコツはありますけど）。観察時期は７日後出ないといけないのでしょうか。あるいは途中で撒き変えるとか。 あるいはプレートにコートを施せないでしょうかね。コラーゲンとかポリリジンとか。 そうすると細胞の接着が早いので均一な細胞懸濁液を加えてやると比較的均一になりやすいです。

(無題) 削除/引用 No.12710-2 - 2024/12/03 (火) 02:02:17 - おお 単に印象だけで書くけどオーバーコンフなのでは？

plateの中央の細胞が剥がれてしまう 削除/引用 No.12710-1 - 2024/12/02 (月) 18:32:37 - 水滴 24 well plateを使用して実験をしています。 １日目　播種→　２日目　ウイルスを添加→　７日目　生存している細胞を染色 というような形で、細胞の生存の割合を目視で見るような実験を行っています。 ２年近くこの実験を何度もしていますが、時々、ウイルスを添加していないwell（細胞死が起こらないはずのwell）でwell中央部分の細胞がごっそり円形に剥げてしまうことや、ウイルスを添加したwellでもそのような異常な剥げ方が起こります。 （ウイルスを添加したwellは細胞が死ぬので、死んだ細胞は剥がれるのですが、 ふつうは均等にはがれ、すりガラスに近い見た目になります。） 細胞のgrowthから、７日目の時点で過度にコンフルになりすぎないような播種密度にしています。（過度にコンフルになる、とは、細胞が増えすぎて圧迫されて小さく見えることや、増えすぎてぽろぽろと剥がれてきてしまうような状態です。） 播種時にはあまり細胞が中央に寄り過ぎないように気をつけていますが、中央に寄ってしまう傾向があります。 特定の細胞でのみ起こる現象ではなく、何故かその実験回の時だけ起こる、というような現象になっています。 このように剥げる原因に心当たりのある方はいますでしょうか。 ご存じであれば教えていただきたいです。

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