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抗体量が偏って反応しているのでは？ 削除/引用 No.12709-9 - 2024/12/17 (火) 17:24:40 - okkaaa 私も同じようになったことがあります。 メンブレンをロールタイプのものを使用していませんか？ 転写面が上にカールしていると、反応時抗体液の中で転写面を上にしても下にしても両端は液だまりで抗体量が多く、中央は少なくなります。 基本のプロトコール通り十分量の抗体量で振盪しながら交代反応させるのが理想的なのは分かっているのですが、貴重な抗体などで抗体量をケチるために抗原量に対して薄い抗体濃度、少ない液量で静置している時に起きやすいような気がしています。 私はプラスチックトレイ上に抗体液（ミニゲルサイズで1mlくらい）をのせ、メンブレンを何度も裏表抗体液となじませてから、転写面を下にして上からパラフィルムを載せて、水平な湿潤箱で室温1時間もしくは4℃オーバーナイトで反応させています。（二次抗体は室温1時間） ムラなくキレイに出したい時は面倒ですが反応時間の途中でも何度かメンブレンを持ち上げてペタペタと反応面の液を循環させるようにしています。 理屈は忘れましたが、少ない液量で静置していると抗体分子が抗原近くでは局所的に枯渇して濃度が薄くなっていると聞いたのでそうしています。 曲がりのないシート状で売っているメンブレンを切って使用する 抗体液量をケチらず振盪orハイブリバックなどを使って振盪しながら均等に反応させる 静置するならメンブレンを平らな状態で均等に反応させる ウエスタン、ちょっとした事でムラになったりあなどれないですよね... 解決しますように！お互い頑張りましょう！

(無題) 削除/引用 No.12709-8 - 2024/12/07 (土) 04:23:49 - おお >[Re:7] あのさんは書きました : > > いずれにせよ、一般的な方法を そうですねぇ。わざとそういうやり方をしていて、抗体が貴重だとか、非常に高価だとか、財政事情とかあるのかもと思えたりもしますが。。。 あと気になるのはケミルミなら反応液が十分浸透しているかとか、、、。

(無題) 削除/引用 No.12709-7 - 2024/12/06 (金) 19:04:44 - あの 机上にサランラップを敷いて、抗体希釈液を置き、 その上にメンブレンを置いて、 乾燥しないようにタッパーを逆さに被せ、数時間インキュベートという方法はあるけど。 いずれにせよ、一般的な方法を質問者はするべきでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.12709-6 - 2024/12/06 (金) 17:52:50 - おお >[Re:5] あのさんは書きました : > 次があやしいですね： > 　メンブレンの上に抗体をのせて湿潤箱で一晩反応 > > 通常はしない方法です。抗体液量が多いのは両端になってもおかしくない。 > 私は経験などないので判断しかねますが、容器に抗体液を置いてその上にカバーする様にメンブレンをおいてはどうだろうか｡メンブレンの上側が乾くのが心配ならさらにプラスティックフィルムを被せるとか｡ メンブレンの上に抗体液、フィルムという順でもいいけど。

(無題) 削除/引用 No.12709-5 - 2024/12/03 (火) 16:31:58 - あの 次があやしいですね： 　メンブレンの上に抗体をのせて湿潤箱で一晩反応 通常はしない方法です。抗体液量が多いのは両端になってもおかしくない。 123456654321とすれば仮説通りになって、654321123456とおけば仮説は棄却という結果になりそう。

(無題) 削除/引用 No.12709-4 - 2024/12/03 (火) 15:28:39 - けいた ご助言ありがとうございます。 メンブレンには白抜けや偏りは認めません。転写はウェットでやっています。 WBのプロトコール自体はいつもと同様で、実際同じサンプルで他の抗体の場合は矛盾ない結果となっています。 しかし、この抗体の場合は、同じサンプルで異なった結果となっています。抗体によってなにか違いが出る可能性もあるのでしょうか。 抗体との反応は、振盪ではなく、メンブレンの上に抗体をのせて湿潤箱で一晩反応させています。

(無題) 削除/引用 No.12709-3 - 2024/12/03 (火) 02:55:22 - おお 抗体との反応時の振盪の仕方はどうでしょうか？例えば水平でぐるぐる回っているタイプとか真ん中が固定されて四隅の水平からの角度が変化するタイプとか（置き方によるかもしれませんが）、真ん中の液量が常に少なかったりするせいかムラ（真ん中と端の染まり具合がちがう）なんてことも起きたりもするようです（多分それでもうまく行っている方もいるかも知れないのでいつもそうだとか絶対だめとまで言うつもりはないですが）。 前後、あるいは左右にだけ動くようなもので、膜の左右で抗体反応液の挙動が変わらないような置き方をするのが理想的かなと思ったりもしてます。 手元にそういうシェーカーが内容であれば抗体反応液量が十分であれば静置で時折手で振ってやるぐらいでも十分でしょう。

(無題) 削除/引用 No.12709-2 - 2024/12/02 (月) 17:59:48 - 774 メンブレン全体をCBBやポンソーで染めたとき、白抜けや偏りはないですか? トランスファーはウェットですか?学生たちの様子を見ていると、うまく固定できていないとウェットは真ん中が薄くなることが多いです。 セミドライならろ紙が十分にバッファーに浸っていないとか(これは抵抗異常で途中で止まるか)空気が抜けてないか。 123456123456ではなく112233445566で流してみたらどうなりますか?

ウェスタンブロットの結果について 削除/引用 No.12709-1 - 2024/12/02 (月) 17:05:25 - けいた お世話になっております。基礎研究の経験が浅いため、基本的な質問かもしれませんが、ご教授いただけたら幸いです。ウエスタンブロットの結果がうまくでず、考えられることや解決方法について相談したくこちらに投稿しました。 現在、細胞からcontrol含めて6つのサンプルを抽出し泳動し、転写して撮影を行っています。同じように結果が得られることを確認するために、同一ゲルに6サンプルをダブルで、トータル12レーンにサンプルを流しております。サンプルは試薬を加えた経過時間ごとに�@control→�A5分→�B15分→、、、�E120分のように場合分けしてあるもので、左側から順番に入れています。つまり左から、�@〜�E、�@〜�Eです。 しかし、目的の抗体は検出されるものの、結果が左右対称にでてしまいます。（左側では�@で検出量が最も多く、徐々に減少していき、右側では�@サンプルで最も少なく、徐々に増加していきます。） 手技自体は何度もやっており、サンプルが混ざるようなことは考えにくいです。スマイリングというわけでもなさそうです。 同一の結果を得られない原因として考えられることや対処方法についてご教授いただけますでしょうか。

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