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PCR産物の収量の定量 トピック削除
No.12705-TOPIC - 2024/11/28 (木) 08:15:17 - 山田
目的の配列が鋳型に含まれているか調べるために、目的の配列にプライマーを作ってPCRをかけて泳動で確認しています。
目的の配列が含まれているとバンドが出て、含まれていないとバンドが全く出ないので、泳動をすればすぐに結果は分かるのですが、効率を上げるため簡易的にでも泳動無しで検出する方法はないかと考えています。
吸光度で定量しようとしてもプライマーか鋳型の影響か、DNA濃度は定量できませんでした。
PCR産物にエチブロを混ぜてUVを当ててもうまく光りませんでした。
何か二本鎖DNA特異的に染めるキットなど、上手くできる方法をご存知の方はいらっしゃいますでしょうか？
定量といってもバンドが出るか出ないかの二択を判別できればいいと思っています。
鋳型は大腸菌のダイレクトPCRを考えています。
　
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(無題) 削除/引用
No.12705-13 - 2024/11/30 (土) 21:48:12 - 健忘
ゲル染色程度の濃度のEtBrを入れたアガロースゲルを数mmの厚さになるようにシャーレに流し込んだものにサンプルを数uLスポットして、染み込んだところでUVで検出するということを大昔に別目的でやったことがありました。プレートは何枚か一度に作って、冷蔵庫で保存しておくことができます。

(無題) 削除/引用
No.12705-12 - 2024/11/29 (金) 15:45:40 - あの
古くからやられているのは、PCR反応チューブにエチブロをちょっとだけいれて、紫外線をあてると、光ってみえるというのがあるけど。


もともとは、電気泳動をできないフィールドワーカーあたりから始まった方法です。

(無題) 削除/引用
No.12705-11 - 2024/11/29 (金) 13:44:07 - う
サンプル数がどの位あって楽したいかによるけど、ゲルに1, 2cm流してみるだけなら10分くらいで済むし、マルチチャンネルピペットでロードすれば、一瞬じゃないの？と思うのは私だけ？
数百数千しらべるんですかね。

(無題) 削除/引用
No.12705-10 - 2024/11/29 (金) 09:23:36 - おお
古典的な方法としてはコロニーハイブリダイゼーションというのもあるよ。
アガープレートの上にニトロセルロースなどを貼り付けて、その特定という配列でハイブリする。昔はRIが使われていたけど、感度はあまり必要ないのでそんなに気にせずできそうな検出方法でなんとかなるとおもう。

これならPCRすら必要ない。

(無題) 削除/引用
No.12705-9 - 2024/11/28 (木) 16:38:14 - VO

泳動しないでも
少なくともそのための試薬とチップは消費するなら
コストも手間もそこそこ

泳動自体を楽にするなら
8連のPCRチューブの間隔で吸い
泳動コームのwell間隔で入れるピペットで一気にアプライしたり
https://www.integra-biosciences.com/japan/ja/electronic-pipettes/voyager

96wellレベルのゲルで大量サンプルをまとめて流すか
24wellでも中間コーム使って2倍数のサンプルを半分の泳動時間で流せば
先染めの作り置きした1％ゲルでも10分以内、有無だけで詰めるなら5分泳動そこそこでも判別はできるのでは

(無題) 削除/引用
No.12705-8 - 2024/11/28 (木) 16:13:25 - 山田
さまざまなご意見ありがとうございます。
結構たくさんのコロニーをつっついて、特定の配列が入っているものをはじいて、というのを手作業でやっているので、一つ一つみると小さな手間でも極力効率化したいな、と思っていた所でした。
しかしみなさんから言われたことを試してみると、皆さんがおっしゃる通り、小手先の工夫をするよりアガロース電気泳動が結局一番頑健でクリアな結果が出ていいのかな、、、と考え始めています。電気泳動の手順をなるべく効率化する方向にした方がいいのかな、と。
SYBR Greenでラップ上で見る方法はコロニーによってはきれいにシグナルが出たので、使えるかもなと思っています。ただそれでもサンプル数が多くなるとコストもかかりますし、泳動の方が結果が全然クリアだったのでどちらがいいかもう少し検討してみようかなと思っています。

(無題) 削除/引用
No.12705-7 - 2024/11/28 (木) 15:31:45 - おお
UV（A260）で測るのはチューブの中の塩基の量が変わらないので測れないのは指摘がありますが、そのためにPCR Clean Upきっととか使いますか？ゲルろ過のスピンカラムでもいいけど（こっちのほうがスッテプが少ないか）。

(無題) 削除/引用
No.12705-6 - 2024/11/28 (木) 15:27:03 - おお
PCRして直ぐに結果が見れるという点ではqPCR（リアルタイムPCR）だとPCR＝検出ですし。

すでに指摘がありますがエチブロやGelRed、サイバーグリーンとか蛍光試薬とまぜて、Transilluminatorの上にラップをはり数microL乗っけて励起光を当てながら写真を取るとラフにdsDNAなどを検出できます。

もうちょっと数値がてたりしたほうがいいのなら上記のようなdsDNA選択的（特異的）な蛍光色素とまぜて、蛍光プレートリーダーなどで測ればいいでしょう。ELISAリーダーなんかも蛍光が見れる機種もありますし確認してみてもいいかもしれません。

最近はNanoDropなどで蛍光が見れる機種もありますしそれを使うか（自身のラボにあればいいけどなければ周りで持ってないか聞いて回ってもいいでしょうね）。

しかし、電気泳動したほうがいいんじゃない？と個人的には思う。qPCRですら電気泳動をしてちゃんとしたPCRがかかっているか確認したほうがいいと言われているぐらいだし（まあ確かに毎回かるかといえばそうでないだろうけど）。そんなに手間かなぁ。

https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Product-Guides/nanodrop-3300-user-manual.pdf

8. Nucleic Acid Quantification .................................................................. 8-1
dsDNA 33258 Hoechst ................................................................ 8-1
dsDNA PicoGreen® (dye)............................................................. 8-1
RNA RiboGreen® (dye) ................................................................ 8-2
Quant-iT™ DNA BR..................................................................... 8-3
Quant-iT™ DNA HS..................................................................... 8-3
Sybr® Green I ............................................................................... 8-4

(無題) 削除/引用
No.12705-5 - 2024/11/28 (木) 12:55:34 - noname
プライマー設計に癖がありますが、LAMP法なら目視で増幅の有無を確認できますね。

(無題) 削除/引用
No.12705-4 - 2024/11/28 (木) 12:36:01 - G25
プライマーだけでなくフリーのdNTPもλmax 260 nmですよ。吸光度では無理。

>PCR産物にエチブロを混ぜてUVを当ててもうまく光りませんでした。
Molecular CloningにSaran wrap methodというのが載っているから参考にして見ては。
トランスイルミネータじゃなくてハンドイルミネータを使うなら別にサランラップじゃなくてプラシャーレなんかでもいいんですが、
とにかくその上EtBrをDNAを10 uLか20 uLくらいの(わたし手では20 uLが具合が良い）水滴中を載せて、UVで蛍光強度をみる。スタンダードととして0〜25あるいは50 ng λDNAの希釈列。

(無題) 削除/引用
No.12705-3 - 2024/11/28 (木) 11:47:38 - 774R
原理的にはqPCRに使うSYBR Greenを加えて蛍光を見ればいいんじゃないでしょうか？
励起ピークが498nm、発光ピークが522nmらしいので、青色ダイオードのイルミネーターで見れる気がします。

(無題) 削除/引用
No.12705-2 - 2024/11/28 (木) 11:36:38 - noname
へんなことをするより、電気泳動が一番早いし確実だと思いますよ。
それか、あまりやる意義を感じませんが、インターカレーター法のリアルタイムPCRで検出するとか。

PCR産物の収量の定量 削除/引用
No.12705-1 - 2024/11/28 (木) 08:15:17 - 山田
目的の配列が鋳型に含まれているか調べるために、目的の配列にプライマーを作ってPCRをかけて泳動で確認しています。
目的の配列が含まれているとバンドが出て、含まれていないとバンドが全く出ないので、泳動をすればすぐに結果は分かるのですが、効率を上げるため簡易的にでも泳動無しで検出する方法はないかと考えています。
吸光度で定量しようとしてもプライマーか鋳型の影響か、DNA濃度は定量できませんでした。
PCR産物にエチブロを混ぜてUVを当ててもうまく光りませんでした。
何か二本鎖DNA特異的に染めるキットなど、上手くできる方法をご存知の方はいらっしゃいますでしょうか？
定量といってもバンドが出るか出ないかの二択を判別できればいいと思っています。
鋳型は大腸菌のダイレクトPCRを考えています。
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