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(無題) 削除/引用 No.12689-20 - 2024/12/03 (火) 12:43:46 - う 幸い、私のラボはアクリルアミドゲルを手作りすることが全く無くなって、TEMEDやAPSって何？って感じになってますが、それでも仕事は何とか進んでます。レトルト食品でも美味しいならいいか、という状態。

(無題) 削除/引用 No.12689-19 - 2024/12/03 (火) 12:24:02 - noname 10x にすると、還元剤とかトリス、SDS、glycerolを入れたらそもそも容積がオーバーしてしまうから、一般的な組成から結構変わってしまうような気がします。

(無題) 削除/引用 No.12689-18 - 2024/12/03 (火) 12:13:12 - あの かけだしさんの書いた、10xSample Buf.に興味があります。 最重要なSDSの20%液はつくれるだろうし、和光とかからでも購入できる。 グリセロールは目的（ロードしやすく粘性をもたせる）から考えて10％でよいでしょう。 一般的でない理由は、何でしょう？還元剤の添加可能量？

(無題) 削除/引用 No.12689-16 - 2024/12/03 (火) 04:12:30 - おお ふとおもうのだけど、最近の生化学とか実習、研究室に入ったときの初期などでバッファーや使う溶液に含まれているものがどんな意味を持っているのか理解するような指導はしてないのでしょうか。 たしかにいまはKit化していて何が入っているかよくわからないままAとBをまぜて、、、みたいなのもおおいけど（これってバッファーの組成とその意味を考えて実験しているとかなり気持ち悪い）。

(無題) 削除/引用 No.12689-15 - 2024/12/03 (火) 04:07:35 - おお 一応やれそうなこととしては２０％SDSを１０分の１量（タンパク量が少ないなら、１０％SDSを１０分の１量でもいいでしょう、１gの蛋白に対して２g弱のSDSがつくということを意識すればいい）、１M DTTを十分の１量（２MEのときは自分で計算して）、グリセロールを１０分の１量入れれば大体サンプルバッファーを加えたのと同じぐらいになる。色素はそれのどれかに加えておけばいい。１００％グリセロールはいれる容量をコントロールしにくいので８０％グリセロールにするとか５００mMDTT、５０％グリセロールプラス色素を５分の１量加えてもいいでしょう。 でもこれって４xサンプルバッファーを加えているのと同じ。

(無題) 削除/引用 No.12689-14 - 2024/12/03 (火) 03:54:49 - おお >[Re:13] みさんは書きました : > >[Re:12] かけだしさんは書きました : > > たくさんお答えがでていますが、当方は10xSample Buf.を自作していまし > いちおう突っ込んどきます > Laemmli bufferの終濃度でいうとGlycerolは10%, SDSは2%ですよね。 > そうなると10x Sample bufferは100% Glycerol, 20% SDSで作製しないといけない。。。その他にTrisやら還元剤やらも入ってくるから調製不可能ですよね？ > DNA sample bufferと勘違いされてません？ > ６xが知っている限り最も高濃度ですね。でもドロドロ感があって使いにくい。

(無題) 削除/引用 No.12689-13 - 2024/12/02 (月) 16:14:54 - み >[Re:12] かけだしさんは書きました : > たくさんお答えがでていますが、当方は10xSample Buf.を自作していました。 > ですので、自分の実験系にあったものを作ってしまうのもありです。レシピはネットなどにいくらでも転がっています。 いちおう突っ込んどきます Laemmli bufferの終濃度でいうとGlycerolは10%, SDSは2%ですよね。 そうなると10x Sample bufferは100% Glycerol, 20% SDSで作製しないといけない。。。その他にTrisやら還元剤やらも入ってくるから調製不可能ですよね？ DNA sample bufferと勘違いされてません？

(無題) 削除/引用 No.12689-12 - 2024/12/02 (月) 15:51:23 - かけだし たくさんお答えがでていますが、当方は10xSample Buf.を自作していました。 ですので、自分の実験系にあったものを作ってしまうのもありです。レシピはネットなどにいくらでも転がっています。

(無題) 削除/引用 No.12689-11 - 2024/11/19 (火) 12:27:02 - 1 SDS sample bufferに入ってるものはSDS電気泳動に必要なので入っています。おまけとかどっちでもいい飾りとかではありません。SDSがないと蛋白質を完全変性できません。グリセロールがないと試料が比重の関係でwellに収まらずwell外へ拡散してしまいます。Tri-HCl pH6.8 bufferはアクリルアミドゲル電気泳動の原理である不連続緩衝系による２段階の濃縮効果を実現するために必要です。BPBはなくても泳動自体はできますが、どこまで流れたか泳動の先端がわからないのでないと困ります。 組織なり細胞なりを可溶化する溶液の量が多すぎるのではないでしょうか。液量を今の半分にするだけでも濃度は倍になります。条件検討していい感じの蛋白質濃度になるように可溶化溶液の液量を調整してみたらどうでしょうか。もしくはもしBCA法で蛋白質濃度測定するならば、直接SDS-sample buffer (x1)（還元剤とBPBは入れないで、assayが済んだ後に加える）で可溶化してもいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12689-10 - 2024/11/19 (火) 05:50:51 - たこ 意味については既出なのでおいといて 6xbuffer(すでに出てたか・・・)使えばいいんじゃないですかね。 サンプルが何かにもよるけどprepするときに濃くなるようにすればいいのではないかと。 できない事情があるなら、これもまた１つ前に出てるcan get signal使えばクリアできるんじゃなかろうかと。 詳しい事情は知らないですが、もしサンプル量が少なくても検出できているなら今のままでもいいのでは・・・？

(無題) 削除/引用 No.12689-9 - 2024/11/18 (月) 17:53:37 - あの それから次を使うと高感度にできるので、必要なサンプル量や抗体量を減らせます 　https://lifescience.toyobo.co.jp/detail/detail.php?product_detail_id=122

(無題) 削除/引用 No.12689-8 - 2024/11/18 (月) 17:50:33 - あの ナカライで、6倍サンプルバッファ出てるけど https://www.e-nacalai.jp/ec2/EC-srchdetl.cfm?jump=EC-srchdetl&syohin=0949914&syubetsu=3 https://www.e-nacalai.jp/ec2/EC-srchdetl.cfm?jump=EC-srchdetl&syohin=0950064&syubetsu=3

(無題) 削除/引用 No.12689-7 - 2024/11/18 (月) 17:02:00 - G25 >pHを下げる だけでなく、陰イオンとしてCl-を入れるというのも

(無題) 削除/引用 No.12689-6 - 2024/11/18 (月) 15:53:17 - G25 ・タンパク質にSDSを抱合させる。SDSを抱合させないとタンパク質ごとに分子量と電荷の比が一定せず、分子量と移動度の相関がバラバラになる。 ボイル処理はSDSの抱合を促進するためですが、逆にSDSがないとボイルでタンパク質が凝固してしまうでしょう。 ・還元剤でジスルフィド結合を切る。 ・pHを下げる->stackingによってサンプルが線状に濃縮。バンドをシャープにする。 >今度、ウェスタンブロッティングをするのですが、サンプル濃度が薄く、1lane当たりの添加量がlaneの許容量を超えてしまっています。 そんなときは、 サンプルタンパク質をTCAやアセトンで沈殿して（TCA沈殿はアセトンなどで十分に洗浄する）乾燥後、少量のサンプルバッファーに懸濁するなどの方法があります。

(無題) 削除/引用 No.12689-5 - 2024/11/18 (月) 15:39:49 - み 重石：Glycerol 可視化：BPB あと３つ重要な役割があるかな 蛋白アプライ量が半分になってもexposeの時間が２、３倍になるくらいじゃないですか？ もちろんサンプル、抗原種、抗体によっては半分になったら検出限界以下になってしまうものもあるかもしれんけど。 サンプルバッファーは２ｘで薄まってしまうなら４ｘとか調製できるけどね。

(無題) 削除/引用 No.12689-4 - 2024/11/18 (月) 15:32:06 - う 困っていることと、質問が合っていないと思うのですが、 濃いサンプルバッファー、４ｘとかを使うとか、ウエルサイズの大きいゲルを使うとかが、対応策でしょう

(無題) 削除/引用 No.12689-2 - 2024/11/18 (月) 15:13:57 - おお >[Re:1] ゆなうなさんは書きました : > > もしそれ以外の意味がないのなら、 ありますよ。バッファーに何が入ってますか？それぞれ意味がありますえ。

ウェスタンブロッティングにおけるサンプルバッファーの意味 削除/引用 No.12689-1 - 2024/11/18 (月) 15:04:03 - ゆなうな お世話になります。 今度、ウェスタンブロッティングをするのですが、サンプル濃度が薄く、1lane当たりの添加量がlaneの許容量を超えてしまっています。 そこでお尋ねしたのですが、サンプルバッファーは泳動にあたってどういった意味があるのでしょうか。 サンプルバッファーには、 �@タンパク質の泳動を助けるため（重石の役割）と�A泳動がどこまで進んだかを確認するマーカーの役割 があると理解しています。 もしそれ以外の意味がないのなら、サンプルに添加する量を減らすことを考えています。 どうぞよろしくお願いいたします。

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