全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12687-5 - 2024/11/18 (月) 17:32:14 - う アフィニティ―精製一回だけで純品にすることの方が難しくて、うっすらくらいは仕方ないと思いますが、できれば別のカラムをもう一段回かけるか、NiNTAだけでで頑張るなら、溶出をグラジエントにして、不純物の少ない画分を取るかのどちらかだと思います。

(無題) 削除/引用 No.12687-4 - 2024/11/18 (月) 15:18:13 - G25 Hisタグ用のアフィニティーカラムは特異性が高くないので、というか内在性のタンパク質で金属に配位結合するものは普通にあるので、キレイに目的のタンパク質だけ単離できるものではないと思っていいいです。そこにこだわるなら最初から他のタグを使います（FLAGとかGSTとか）。 一般論として、非特異的あるいは目的外のタンパク質の吸着を防ぐ方策として、 ・イオン強度を高くする。NaCl 0.2~0.3 M程度を基本として、必要に応じて最大2 Mくらいまで。 なぜだかQiagenのマニュアルでは非変性のときはNaClを加えて変性のときは加えないようになっているみたいだけれど、一般的にはどちらの場合もNaCl加えるのが普通だと思います。 ・preclearする（アフィニティーカラムにかける前に、リガンドのついていないゲル担体に通してそれに非特異的吸着するタンパク質を除去する）。実感としてはあんまり効かないけれど、 あとは、 ・イミダゾール濃度を上げながら溶出液を分取する。うまく行けば標的とそれ以外が分画できるかも。 ・アフィニティ精製後、ゲルろ過で分子量による分画をする。

(無題) 削除/引用 No.12687-3 - 2024/11/17 (日) 04:06:52 - おお 変性させているのでこのケースは当てはまらないかもしれないが、ヒートショックプロテインがものにくっついてくる事があるらしいです。 ATPを加えてしばらくインキュベーションして外すとかいう方法があったような気がします｡

(無題) 削除/引用 No.12687-2 - 2024/11/17 (日) 03:35:30 - おお >[Re:1] upさんは書きました : > > プロトコルとしては、 > １．OD600=0.5時点で終濃度1 mMIPTGを加え、37℃3時間振盪 > ２．遠心しペレットにPBSを加え懸濁 > ３．4℃で遠心し、ペレットに8 M尿素を含むPBを加え懸濁し、4℃で遠心 この2回目の遠心を出来るだけ高速にする｡超遠心機があるなら100000gぐらいでもいいぐらい。つまらないならフィルターを通すというのもある。 > ４．上清を回収し、翌日アフィニティークロマトグラフィー 上清にNiのついてない支持体だけの樹脂を加えておくと非特異な吸着をするタンパクをあらかじめ除く事ができる｡ > ５．樹脂（2 mL）を純水5倍量で洗浄 いきなり平衡化バッファーではいいですよ。どれだけ効果があるかわかりませんけど樹脂はPVPでブロッキングする人がいる。 > ６．5倍量の0.2 Mリン酸バッファー（pH8）を加え平衡化 この時点でイミダゾールが入っていてもいい｡ このバッファーや以下のバッファーに200から300mMのNaClを入れておくとイオン相互作用が関与するノンスペが軽減できる事がある｡尿素も4Mぐらい入れておいた方が無難。 > ７．カラムに回収した上清全量加え、20分間転倒混和 上記のように塩とイミダゾールが上清に入っていてもいい。 > ８．5倍量の0.2 Mリン酸バッファー（pH8）を加え平衡化 尿素を抜く必要性がなければ4Mぐらいでも入れておく。抜きたいなら一旦尿素入りバッファーで洗浄後抜いたバッファーに置換。 > ９．5倍量の10 mMイミダゾールを加え洗浄 > 10．5倍量の0.2 Mリン酸バッファー（pH8）を加え平衡化 このステップは必要ない｡ > 11．250 mMイミダゾールを加え溶出 できれば徐々にイミダゾールを増やして行った方がいい。 25、50、75、100、150、200、250と段階的に上げていって目的のタンパクが溶出したフラクションを回収(グラジエントメーカー使ってもいいけど)。あるいは小スケールでどのイミダゾール濃度で溶出されるか確認してその濃度ー50mM ぐらいのイミダゾールで洗浄してから溶出が確認できた濃度で溶出｡あるいはその濃度から10mM ずつとかちょっとずつ上げていくとか｡ > > 目的タンパク質が単離できない原因としては、変性条件下であるが、8 M尿素を含むバッファーを使っていないことや洗浄時のイミダゾール濃度が低いことなのか、それとも他に原因があるのかわからないです。 > もし大腸菌をTritonの入ったバッファー(0.1から1%ぐらい)やリゾチウム含むバッファーでLysisしても目的のものの殆どが溶出しないなら遠心して目的のタンパクをペレットにエンリッチできます｡ > 再度アフィニティークロマトグラフィーを行う際の改善点を教えていただきたいです。 手元にある物を薄めるなどして再度カラムに乗せイミダゾールの濃度を徐々に上げながら溶出してもいい。あるいはDEAEなどのイオン交換に乗せて違った特性で分離するといい｡意外とNi ビーズは共雑物が精製物に混じりやすい。 >

ヒスチジンタグタンパク質の単離 削除/引用 No.12687-1 - 2024/11/16 (土) 23:58:37 - up 現在、ヒスチジンタグを含むタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって単離させようとしています。 SDS-PAGEの結果では、目的タンパク質（17.5 kDa）の他に37〜50 kDa間に非目的バンドがうっすらと確認でき、単離できない状況です。 プロトコルとしては、 １．OD600=0.5時点で終濃度1 mMIPTGを加え、37℃3時間振盪 ２．遠心しペレットにPBSを加え懸濁 ３．4℃で遠心し、ペレットに8 M尿素を含むPBを加え懸濁し、4℃で遠心 ４．上清を回収し、翌日アフィニティークロマトグラフィー ５．樹脂（2 mL）を純水5倍量で洗浄 ６．5倍量の0.2 Mリン酸バッファー（pH8）を加え平衡化 ７．カラムに回収した上清全量加え、20分間転倒混和 ８．5倍量の0.2 Mリン酸バッファー（pH8）を加え平衡化 ９．5倍量の10 mMイミダゾールを加え洗浄 10．5倍量の0.2 Mリン酸バッファー（pH8）を加え平衡化 11．250 mMイミダゾールを加え溶出 目的タンパク質が単離できない原因としては、変性条件下であるが、8 M尿素を含むバッファーを使っていないことや洗浄時のイミダゾール濃度が低いことなのか、それとも他に原因があるのかわからないです。 再度アフィニティークロマトグラフィーを行う際の改善点を教えていただきたいです。

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---