テクニカルに問題が発生している訳ではありません。が、皆様がどうされているか知りたくてトピを上げさせて頂きます。
ベクター構築の際にPCR産物を使うことは多いと思いますが、PCRで増やした後の塩基配列、きっちり確認していますか？
例えば「5.6 kbpのバックボーンベクターにPCRで増やした1.5 kbpの産物を挿入した」場合に、ベクター側のT7 promoterやBGH reverseなどからインサートの塩基配列を読んで確認するのが常道だと思います。インサートが長くてそれだけでは読み切れない場合、自分でプライマーを設定してインサート全長を読むようにするとも思います。
これは恐らくベクター構築の場合にはルーチンできっちりやられているはず、だと思ってました。
で、これが例えばSite Directed Mutagenesisを行う時など、ベクターを一周分増幅させた場合は、Mutationが入ったかどうかだけ確認して、そこ以外の配列を確認しなかったりしてませんか？
最近ご近所ラボの方々とベクター構築の話になって、塩基配列の確認をあまりしない、全然しないという人が多くてビックリしました。上のSite Directed Mutagenesisの場合のみならず、PCRで増幅したインサートすらも確認しない人が半数ほどいました。
自分の中の常識だと、PCRで増幅したものは（たとえ評判の良いproofreadingのものを使ったとしても）必ず塩基配列を確認するべきだと思ってました。上記のSite Directed Mutagenesisの場合は全長をシークエンスにかけるのは面倒なので、配列を確認したMutationを含む領域を適当な制限酵素で切って、元のベクターとexchangeするのが普通と考えてました。
もしかして、今となってはproofreading enzymeで増幅したものはシークエンスを確認しないのが普通になったりしているのでしょうか？ここを読まれている皆様は普段どうされているのか、教えて頂けたら有り難いです。よろしくお願い致します。
（まあ、仮に「今時は確認しない」と言われても、私はずっと確認していくんだろうなとは思うのですが……）
1）確認しない
2）確認する
3）ベクターバックボーンの部分は確認しない。exchangeもしない
4）ベクターバックボーンの部分も確認するかexchangeする
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