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(無題) 削除/引用 No.12685-12 - 2024/11/21 (木) 11:43:29 - あ 私はインサートだけ配列確認しますが、かなりの変異導入プラスミドをつくりましたけど、エラーが入ったことが一度もないです。なので外側をシーケンスするのをやめました。KODpolです。

(無題) 削除/引用 No.12685-11 - 2024/11/19 (火) 15:21:08 - G25 >3）ベクターバックボーンの部分は確認しない。exchangeもしない インサートと発現系に関与するプロモータなどはPCRベースでなくても確認します。大腸菌の複製システムとて完璧でないので、万が一、変異の入ったクローンを拾ってしまって、そのままダウンストリームの実験をして出るはずだった結果が出ないとかアーティファクトを信じ込んだりしたら怖いではないか。 バックボーンに関しては、変異が起こったとしても、プラスミドが殖えないとか、マーカーが発現しないとか、実害が現れていないのであれば構わないはず。そういうベクターとしての機能が損なわれていないクローンを拾っているはず。

(無題) 削除/引用 No.12685-10 - 2024/11/19 (火) 12:14:29 - toto AAさんが書かれてたナノポアのエラーの懸念ですが、今のversionでは実際に調べると99%超の精度はあるので、リードが十分数あれば、ほぼ読み間違いにはなりません。外注の場合、コンセンサスだけでなく、各リードの配列をigvで確認した方がいいです。

(無題) 削除/引用 No.12685-9 - 2024/11/18 (月) 00:30:37 - Mont 昔はインサートの全長だけシークエンスしてました。 今は、https://plasmidsaurus.com/ に送って、プラスミドも含めて全てシークエンスしています。 研究施設全体で契約し、配送無料の集荷ボックスを施設内に設置、平日毎日集荷してくれて、ほとんどの場合、翌日に結果が送られてきます。私は北米在住ですが、1検体15ドル程なので、欧米ではココが主流に使われているようです(調べたわけではありませんが)。

(無題) 削除/引用 No.12685-8 - 2024/11/17 (日) 16:46:08 - おお 特にバックボーンの場合、複数のクローンを取ればひとつだけ挙動がおかしいとかで弾ける可能性はありますね｡確実な方法ではないですけど実験によってはそれでもいいのかも｡

(無題) 削除/引用 No.12685-7 - 2024/11/17 (日) 16:16:16 - AA 最近はナノポアを使ったプラスミド全長シーケンスが安い(4千円くらい)ので、それをやって期待と違う配列の部分だけサンガーで読み直しています。 ナノポアのエラー率はそこそこ高いので予想通りと判定した部分がじつは違うということはあるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12685-6 - 2024/11/17 (日) 08:48:57 - muta 大本は購入品で、確認はしない 配列確認は 変異箇所だけコロニーPCRで産物を見る 完成品、精製プラスミドのインサート部分を確認 よほどでないと完成品の全長は見ない ごくごく稀にベクターに変異が入ってた時はあった （TFして細胞の挙動から巻き戻って発覚） コロニーPCRで綺麗に読めてたのが精製プラスミドで波形見れない（濃度純度バンドは問題なし）のはままある

(無題) 削除/引用 No.12685-5 - 2024/11/16 (土) 20:42:13 - 小心者 目的に応じて3)か4）。 プラスミド丸読みサービスがキャンペーンで安かったときには2)を試して満足しました。海外なみの価格になればこれを使いたいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.12685-4 - 2024/11/16 (土) 11:53:44 - TS ３か４です。 実験の目的によっても必要性は変わってくるかなと思います。 例えば、ルシフェラーゼを使ったプロモーターアッセイなどの場合、site-directed mutagenesisをしたとき、プロモーターに変異を入れたせいで活性が変化したのか、ルシフェラーゼに変異が入ってしまって活性が変化したのかわからなくなるので、乗せ替えないとまずいかなと思います。 >最近ご近所ラボの方々とベクター構築の話になって、塩基配列の確認をあまりしない、全然しないという人が多くてビックリしました。上のSite Directed Mutagenesisの場合のみならず、PCRで増幅したインサートすらも確認しない人が半数ほどいました。 日本ですか。ちょっとあり得ないかなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.12685-3 - 2024/11/16 (土) 09:01:42 - おお ３か４ 必要におおじてどちらか決める。 ベクター側の配列もAmpやOriまで見る必要ないかもしれない。プロモーターのリポーターアッセイとかだと別かもしれないけど。

(無題) 削除/引用 No.12685-2 - 2024/11/16 (土) 06:49:23 - 774R そのプラスミドが機能してれば十分という実験なら3)ですね。 変異を入れてWTと比較する実験だと発現量による影響もあるのでプロモーターなどのバックボーンの影響も無視できないけどWBで確認して同程度ならOKとしてます。 プラスミド全長を確認する時、長いやつだとリード数が増えてプライマー代とシーケンス費用が高額になりますが、最近だとNGSでまるっと読むサービスが楽です。

ベクター構築の際のPCR産物の塩基配列の確認について 削除/引用 No.12685-1 - 2024/11/16 (土) 06:06:18 - 苦労人 テクニカルに問題が発生している訳ではありません。が、皆様がどうされているか知りたくてトピを上げさせて頂きます。 ベクター構築の際にPCR産物を使うことは多いと思いますが、PCRで増やした後の塩基配列、きっちり確認していますか？ 例えば「5.6 kbpのバックボーンベクターにPCRで増やした1.5 kbpの産物を挿入した」場合に、ベクター側のT7 promoterやBGH reverseなどからインサートの塩基配列を読んで確認するのが常道だと思います。インサートが長くてそれだけでは読み切れない場合、自分でプライマーを設定してインサート全長を読むようにするとも思います。 これは恐らくベクター構築の場合にはルーチンできっちりやられているはず、だと思ってました。 で、これが例えばSite Directed Mutagenesisを行う時など、ベクターを一周分増幅させた場合は、Mutationが入ったかどうかだけ確認して、そこ以外の配列を確認しなかったりしてませんか？ 最近ご近所ラボの方々とベクター構築の話になって、塩基配列の確認をあまりしない、全然しないという人が多くてビックリしました。上のSite Directed Mutagenesisの場合のみならず、PCRで増幅したインサートすらも確認しない人が半数ほどいました。 自分の中の常識だと、PCRで増幅したものは（たとえ評判の良いproofreadingのものを使ったとしても）必ず塩基配列を確認するべきだと思ってました。上記のSite Directed Mutagenesisの場合は全長をシークエンスにかけるのは面倒なので、配列を確認したMutationを含む領域を適当な制限酵素で切って、元のベクターとexchangeするのが普通と考えてました。 もしかして、今となってはproofreading enzymeで増幅したものはシークエンスを確認しないのが普通になったりしているのでしょうか？ここを読まれている皆様は普段どうされているのか、教えて頂けたら有り難いです。よろしくお願い致します。 （まあ、仮に「今時は確認しない」と言われても、私はずっと確認していくんだろうなとは思うのですが……） 1）確認しない 2）確認する 3）ベクターバックボーンの部分は確認しない。exchangeもしない 4）ベクターバックボーンの部分も確認するかexchangeする

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