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(無題) 削除/引用 No.12683-12 - 2024/11/18 (月) 22:40:08 - toto そういえば遠い昔、linkerで苦労したことを思い出しました。今では、overlapつけたprimerでＰＣＲやってIn-Fusion/NEBuilderして繋ぐのが普通です。良い時代になりました。

(無題) 削除/引用 No.12683-11 - 2024/11/16 (土) 09:10:40 - おお Plan Bとして両側平滑でいれるのも並行してやってもいいかも（フレームなど無視できるなら）。 難しいと思う人もいるようだけど、しっかりコントロールできている系では意外と簡単に取れたりするし。

(無題) 削除/引用 No.12683-10 - 2024/11/16 (土) 02:32:11 - おお >>良いサイトが無い方だけを切ってブラントエンドにしてからNotIで切った断片どうしをランゲ―ション >　複数の方がおっしゃっているように、これが王道なのですね。 昔からある手法です。また少しめんどくさいのですが、一度インサート（にしたい）断片をクローニングベクター(pBlueScript, pUC, pGen番号）などマルチクローニングサイトが豊富なプラスミドに挿入してできたクローンのインサート周辺の制限酵素サイトを利用していれることもやられていました。 平滑末端処理はクレノーがよく使われています（いました）が、いまやhigh-fidelity PCR enzymeの２XMixとか出回っていますのでてもとにあれば平滑末端処理したい断片の溶液と１：１で混ぜて７２度で数分インキュベーションするだけで済んでしまいます。 余談ですが、partial fillというテクニックもあって、Xba I と Hind IIIとかの切断部分をつなげることもできたりする。 https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC318626/pdf/nar00322-0105.pdf

(無題) 削除/引用 No.12683-9 - 2024/11/16 (土) 01:29:47 - 通りすがり 皆様、いろいろと教えていただきありがとうございました。 >>断片はNotIを含め全て３’突出になります。 >5'突出ですよね。 　そうです。書き間違えました。すみません。 〉良いサイトが無い方だけを切ってブラントエンドにしてからNotIで切った断片どうしをランゲ―ション 　複数の方がおっしゃっているように、これが王道なのですね。 〉インサートの両側に制限酵素サイト付きのプライマーを設計して、PCRした断片を入れれば良くね？ 　これのいい点は、買う制限酵素を一つ減らせる点ですね。 　大変参考になりました。皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12683-8 - 2024/11/15 (金) 17:54:48 - か インサートの両側に制限酵素サイト付きのプライマーを設計して、PCRした断片を入れれば良くね？ 納品待てるなら、それが一番楽のような。

(無題) 削除/引用 No.12683-7 - 2024/11/15 (金) 12:26:21 - G25 >断片はNotIを含め全て３’突出になります。 5'突出ですよね。 1) Not 1じゃない方で消化。dNTPとKlenowを加えておく（即平滑化） 2) 熱失活できる酵素ならそうする。でなければPCI抽出など。 3) Not1で消化 4)ゲル切り出し精製 で、Not 1と平滑末端を生じる酵素で切ったベクターにいれる。 平滑末端の認識サイトがなければ、上記と同様にしてNot 1/Bluntの末端を作る。 これが一番オーソドックスでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12683-6 - 2024/11/15 (金) 11:48:32 - う 私なら、 良いサイトが無い方だけを切ってブラントエンドにしてからNotIで切った断片どうしをランゲ―ションしますが、 合成オリゴの納品を待つ時間があるなら、合成オリゴリンカーで埋める

(無題) 削除/引用 No.12683-5 - 2024/11/15 (金) 11:09:35 - リンカー >むかしはLigationようにこういうのを売っていたんですけど、今は見当たりませんねぇ。。。まあオリゴを注文すればいい話ですけど。 そう、昔は売ってましたよね？投稿前にちょっと調べたけど見つからなかったので、あれぇ？と思ってました。まあ、プライマー注文する要領で作れば1000円程度で一生使いきれない程手に入るからなあ。私も既製のものは買ったことなかったし、商売にならなかったかな？

(無題) 削除/引用 No.12683-4 - 2024/11/15 (金) 10:32:47 - おお 2）Linkerを使う 例：NotIをXhoIに変えるリンカー GC - 3' CGCCGG -5' むかしはLigationようにこういうのを売っていたんですけど、今は見当たりませんねぇ。。。まあオリゴを注文すればいい話ですけど。

(無題) 削除/引用 No.12683-3 - 2024/11/15 (金) 07:28:47 - リンカー 1）突出末端を削り、平滑末端同士でライゲーション。コロニーをたくさん拾って、正しい向きに、一個だけインサートが入っていたベクターを選別する（サンガーシークエンスか、　向きを判別できるような制限酵素を選んでの制限酵素処理からの電気泳動で。平滑末端なのでインサートが複数入る場合もありえることに注意。それ以上に、ベクターのセルフライゲーションの方が問題になることが多いので、ベクター、インサート比を1:10とかにしてやってる人を多く見た） 2）Linkerを使う 例：NotIをXhoIに変えるリンカー GC - 3' CGCCGG -5' というNotI制限酵素処理済みの突出末端に対して（これって5'突出じゃなかろうか？） 5'- GGCCaagCTCGAGctt -3' というオリゴを合成してライゲーションすると GC GGCCaagCTCGAGctt GGCCaagCTCGAGctt -------- 3' CGCCGG ttcGAGCTCgaaCCGG ttcGAGCTCgaaCCGG -------- 5' と、オリゴがNotI切断部位に無数にライゲーションしていく GCGGCCaagCTCGAGcttGGCCaagCTCGAGctt -------- 3' CGCCGGttcGAGCTCgaaCCGGttcGAGCTCgaaCCGG -------- 5' (上ではオリゴが全部で4つついた形だけど、6つつくかもしれないし、もっと多いかもしれない。逆に2個だけの場合もありえる） CTCGAGがXhoI認識配列なので、これをXhoIで切断すれば GCGGCCaagC -3' CGCCGGttcGAGCT -5' となって、XhoI切断末端とライゲーション出来るようになる （オリゴが何個つこうとも、XhoI処理後には上のようになる） （小文字のaagとcttは、仮にオリゴが2個しかつかなかった場合でも制限酵素処理で良く切れるようにとつけとくもの、らしい。別に他の塩基でも構わない。つけない人もいると聞いた。私は念の為につけてやってた） （デザインをちょっと工夫すれば、NotI認識部位を保存しておいたり、制限酵素認識部位を複数入れることも出来る） お勧めは2)のリンカーを使う方法。 今時はなんでもIn-Fusionとかでやっちゃうから、制限酵素で切ってライゲースでくっつけて、って経験が少ない人も多くなりましたね。

(無題) 削除/引用 No.12683-2 - 2024/11/15 (金) 06:39:07 - おお 片側平滑（ブラント）でいいのでは。それのほうが方向がさだまるし。 ベクター側のNotと反対側にSmaIとかEcoRVとかあればそれを使えばいいし、他の制限酵素でもまずそれで切って平滑末端処理をしてからNotIで切ればいい。

片方の制限酵素が合わない 削除/引用 No.12683-1 - 2024/11/15 (金) 03:50:08 - 通りすがり 　本当に基本的なことでお恥ずかしいのですが、教えていただけますと幸いです。 　インサートを切り出し、ベクターにライゲーションするだけの作業なのですが、片方はNotI同士でくっつけられるのですが、反対側に同じ制限酵素、およびcompatible (SalI-XhoIのような）がありません。このような場合、どのようにするのが一番良い方法なのでしょうか。断片はNotIを含め全て３’突出になります。 　よろしくお願いいたします。

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