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RT-PCRのネガティブコントロール増幅 トピック削除
No.12678-TOPIC - 2024/11/13 (水) 15:18:26 - A
現在RT-PCRを用いて、目的遺伝子の定量を行おうとしています。
しかし新しく用意したプライマーの検討を行ったところ、ポジティブコントロールである希釈系列とともにネガティブコントロールでも増幅してしまいました。メルティングカーブやCt値もポジティブコントロールと一致してしまっていることから、コンタミを考えすべての試薬を新しくしましたが、同様の結果となっています。またプライマー精度の確認としてすでに一度ＮＣで出ないことが確認されている他の遺伝子のプライマーも同様にＰＣＲを行ったところ、こちらでもＮＣで出てしまいました。
スタンダードによる検量線はしっかりと直線で出ているのですが、ＮＣでもはっきりとピークが上がっています。

最も可能性が高いのはやはりコンタミだと思いますが、ここまですべての場合で出てしまっているとなるとどこで汚染されているかわからない状態です。
この場合の対処方法として何かあれば教えていただきたいです。
　
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(無題) 削除/引用
No.12678-10 - 2024/11/15 (金) 12:52:54 - G25
標的配列、プライマー位置のデザインを変える。
日頃しまくっているPCR産物による汚染の可能性が高いので、
同じ遺伝子でも、これまでのPCR産物上にない配列をプライマーにする。

以後、dUTP入りの系でPCRするようにしてPCRにUNGの前反応を行うことをルーチンにする。

(無題) 削除/引用
No.12678-9 - 2024/11/14 (木) 23:58:18 - A
PCR産物を電気泳動してサイズ確認してみたらどうでしょう？

そうですね、確かに増幅しているものが何なのかは確認する必要がありそうです。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.12678-8 - 2024/11/14 (木) 12:03:34 - 774R
>どのような原因が考えられるのでしょうか…

PCR試薬
水
プライマー
チューブ
チップ

上記の全てを新しくしても出るようなら、なにか想定外の産物が出来てるのかも？
メルティングカーブが偶然一致する可能性もゼロではないので、PCR産物を電気泳動してサイズ確認してみたらどうでしょう？

(無題) 削除/引用
No.12678-7 - 2024/11/14 (木) 09:25:12 - A
>[Re:6] 774Rさんは書きました :
> 「Ct値は30程度でした。ポジコンでは1000倍希釈と同程度になります。」
>
> 「Ct値もポジティブコントロールと一致」
>
> 一致ってなんだったの？

言葉足らずでしたが、ポジコンとして希釈したテンプレートを使用しており、そのうちの1000倍希釈サンプルとCt値が一致しており、解離曲線もピークが同じということです。そのためダイマーの可能性は少ない、という意図でした。

(無題) 削除/引用
No.12678-6 - 2024/11/14 (木) 08:18:25 - 774R
「Ct値は30程度でした。ポジコンでは1000倍希釈と同程度になります。」

「Ct値もポジティブコントロールと一致」

一致ってなんだったの？

(無題) 削除/引用
No.12678-5 - 2024/11/14 (木) 04:09:06 - A

> ちなみにCt値はどれぐらいですか？
> ポジコンと一致するって相当量なので一部の量が混入するようなコンタミとしてはちょっと考えられないくらいの量のように思えます。

Ct値は30程度でした。ポジコンでは1000倍希釈と同程度になります。


> ゲノムからの増幅はしないようなデザインですか？NCはなんですか？水？rt-？

しないようなデザインです。NCには水を用いました。

発現が(+/-)になるようなサンプルに対してpcrをした結果、HK遺伝子で補正すると発現量に大きく差が出ていたので、定量する上では大きく影響しない量のコンタミかと思ったのですが、相当量だとするとどのような原因が考えられるのでしょうか…

(無題) 削除/引用
No.12678-4 - 2024/11/14 (木) 02:58:07 - おお
>メルティングカーブやCt値もポジティブコントロールと一致

ちなみにCt値はどれぐらいですか？
ポジコンと一致するって相当量なので一部の量が混入するようなコンタミとしてはちょっと考えられないくらいの量のように思えます。

(無題) 削除/引用
No.12678-3 - 2024/11/14 (木) 00:35:41 - おお
ゲノムからの増幅はしないようなデザインですか？NCはなんですか？水？rt-？

(無題) 削除/引用
No.12678-2 - 2024/11/13 (水) 15:37:03 - noname
空間の汚染も考えられるので、こういう時は実験台、ピペットマンなどを清掃後、1週間ほど触らないというのも効果的です。

RT-PCRのネガティブコントロール増幅 削除/引用
No.12678-1 - 2024/11/13 (水) 15:18:26 - A
現在RT-PCRを用いて、目的遺伝子の定量を行おうとしています。
しかし新しく用意したプライマーの検討を行ったところ、ポジティブコントロールである希釈系列とともにネガティブコントロールでも増幅してしまいました。メルティングカーブやCt値もポジティブコントロールと一致してしまっていることから、コンタミを考えすべての試薬を新しくしましたが、同様の結果となっています。またプライマー精度の確認としてすでに一度ＮＣで出ないことが確認されている他の遺伝子のプライマーも同様にＰＣＲを行ったところ、こちらでもＮＣで出てしまいました。
スタンダードによる検量線はしっかりと直線で出ているのですが、ＮＣでもはっきりとピークが上がっています。

最も可能性が高いのはやはりコンタミだと思いますが、ここまですべての場合で出てしまっているとなるとどこで汚染されているかわからない状態です。
この場合の対処方法として何かあれば教えていただきたいです。
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