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(無題) 削除/引用 No.12673-18 - 2024/11/13 (水) 14:29:14 - G25 >T4 ligaseもT4 kinaseも同じ反応バッファで良いので（どちらもATP含有）、同時反応も可能だったはず。 それ前提のinverse PCR mutagenesis kitもありました https://lifescience.toyobo.co.jp/detail/detail.php?product_detail_id=1

(無題) 削除/引用 No.12673-17 - 2024/11/12 (火) 18:47:39 - G25 T4 ligaseもT4 kinaseも同じ反応バッファで良いので（どちらもATP含有）、同時反応も可能だったはず。 λファージライブラリ作成のアダプタライゲーションか何かでそういうプロトコールでやった記憶がある

(無題) 削除/引用 No.12673-16 - 2024/11/12 (火) 17:29:48 - おお 2回反応が必要なのは変わらないけど、プライマーをリン酸化してからPCRをかけるてもあります(そちらの方がリン酸化の効率がいい)｡PCR反応液の10倍かそれ以上の濃度でリン酸化してそのままリン酸化反応溶液を使えばいい。

(無題) 削除/引用 No.12673-15 - 2024/11/12 (火) 16:09:53 - 774R 同僚がPCRのセルフライゲーションで、リン酸化とLigationを同時に行ってますが、普通に上手くいってるみたいです。 Ligation溶液にATPは既に入ってるので、PNKを加えるだけ。

(無題) 削除/引用 No.12673-14 - 2024/11/12 (火) 16:02:49 - toto ご指摘のようにinversePCR断片をligaionするのもシンプルな解決策です。ただ、リン酸化オリゴはかなり高いのでPNKをつかうのが一般的ですが、そのあとでligationと、2回の反応が必要です。一つのコロニーさえ取れればいいとはいっても、効率はoverlapつきのinvPCR断片をNEBuilder/In-Fusionのほうが圧倒的に高く、NEBuilderであれば1uL使えば十分な量のコロニーができて、deletion シリーズなどを作る場合は断然楽です。 ただ、いずれにしても、inversePCRする場合はプラスミド全長の配列確認が必要なので、どちらが正確ということはないにしても、都合のいい制限酵素サイトがあるならば、そのほうがサンガーですむのでいいということもあるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.12673-13 - 2024/11/12 (火) 02:11:01 - おお オーバーラップさせたりする必要もなくInverse PCRでセルフでライゲーションすればできます（末端がリン酸化されている必要があるのでリン酸化されたプライマーか、リン酸化を施すステップが必要ですが）。個人的にはあまり複雑化しないほうがいいと思いますし、NEBuilderなど特化した試薬を使う必要もないので（今ではスタンダードだと言われるかもしれませんけど）。 もちろんそれぞれうまくいった実績のある方法論ではあると思いますけど、個人的には配列などの依存性による成功率のブレが広いのではとちょっと思ったりもします。

(無題) 削除/引用 No.12673-12 - 2024/11/11 (月) 17:36:06 - 774R いや、待てよ？ 対岸にアニールするとされるプライマーの相補長は15bpしかないんですよね？ とても普通のPCR条件でアニールしてるとは思えない。 実は、overhangなんか生じてなくて、平滑末端になってるでしょう。 で、やっぱり菌内の3'->5'exonuclease活性で削られて出来た末端同志がアニールして環状化したのでは？

(無題) 削除/引用 No.12673-11 - 2024/11/11 (月) 17:24:04 - 774R これは知りませんでした。 inverse PCRでプライマーに15bpのoverlapを設けると、伸長前に対岸にプライマーがアニールし、そこで伸長が止まり、15bpのoverhang（突出末端）が出来るんですね！！ 付着したプライマーをどかさないようPCR酵素にdisplacement activityが無いことが条件のようですね。 実は、上記の事を知らず、思い付きでKOD Oneで15bp overlapプライマーでinverse PCRをした後、In-Fusion反応を行わずにトラフォメしたことがあるのですが、見事に目的のコンストラクトが完成したことがありました。 私的には菌内の3'->5' exonuclease活性によりIn-Fusionと同じことが起こることを期待して行った実験だったのですが、overlapするプライマーにより伸長が止まり15bpのオーバーハングが出来てたかもしれないのか。 ちょっと調べたら、KODもdisplacement activityが非常に弱いと書かれていた。

(無題) 削除/引用 No.12673-10 - 2024/11/11 (月) 15:23:34 - AA 欠失したい部分の両端からぐるっと反対側までPCRで増幅するようにプライマーを設計し、その末端に15bpほどの騒動配列を設計しておくとPCR産物をそのままコンピテントセルへ持ち込むだけで目的のプラスミドが得られます。 下記はタカラの製品情報ですがキットの中身はPCR酵素とコントロール実験用のセットなのでこのキットを買う必要はなく、正確性の高い酵素さえ有ればあとはプライマーを設計購入するだけです。 ttps://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100005179 特別な試薬がいらなくて便利なので試されるといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.12673-9 - 2024/11/11 (月) 14:41:17 - toto 誰も書かないので。もちろん制限酵素で使えるサイトがあればそれで良いですが、今では、ここで何度も出てきたように、削りたい配列の外側を逆向きに増やすようなprimerセットを選び、その片方に、一方のprimer配列を15-20merくらい含めていわゆるinverse PCRして、そのバンドをNEBuilderかinFusionすれば望みの配列を持つベクターが簡単にできますよ。ちょっとだけずらしたdeletionセットなども容易です。

(無題) 削除/引用 No.12673-8 - 2024/11/11 (月) 12:59:35 - 寄り道 そのプラスミドの配列か、遺伝子部分の配列のアクセッションナンバーをここに書けばみんなで考えてもらえますよ、差しさわりが無ければですが。

(無題) 削除/引用 No.12673-7 - 2024/11/11 (月) 10:48:54 - あ その遺伝子の中の制限酵素サイト２つ、同じ制限酵素サイトでも違う制限酵素サイトでもいいのでなるべく離れているものを選んで、切断してセルフライゲーションさせるのが良いと思う。 文章でわかりにくければ後で絵にします。

(無題) 削除/引用 No.12673-6 - 2024/11/10 (日) 23:31:44 - 通りすがり >あかねさん 〉G25さん 　いろいろ教えていただきましてありがとうございました。 　そもそもの点で、EcoNIサイトが遺伝子のどこにあるかも考えていなかったのが大きな問題点でした。遺伝子はTetRなのですが、フレームシフト後にできるタンパクが機能を持つ（DNAにくっつく）可能性があるか考え、今後の計画を立てようと思います。

(無題) 削除/引用 No.12673-5 - 2024/11/10 (日) 16:01:56 - G25 > EcoNIは5'突出末端ですね。 申し訳ない。私の勘違いです。混乱させてごめんなさい

(無題) 削除/引用 No.12673-4 - 2024/11/10 (日) 11:36:41 - あかね EcoNIは5'突出末端ですね。 KlenowやKODで埋めれます。 T4 DNA polはG25さんがご指摘されているように、削り込み活性が強いので、おすすめしません。 Mung Bean Nucleaseなどを使えば、ssDNA部分を削れますが、おそらく手元にないかと思いますので、Klenow等のFill inをおすすめします。

(無題) 削除/引用 No.12673-3 - 2024/11/10 (日) 10:46:31 - 通りすがり ＞G25さん 　ありがとうございました。大変参考になりました。 １．Klenowで埋めることはできないのですね。 ２．T4 DNAポリメラーゼは突出部分以上に切ってしまうことがあるのですね。 ３．これを考えなかったことが一番恥ずかしいのですが、フレームシフト後にできたタンパクが機能をまだ持っていたり、逆にEndogenousなものの機能を阻害したりする可能性を深く検討しなくてはならないのですね。 　おすすめいただいた方法を含め、別の方法が安全と思うに至りました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12673-2 - 2024/11/10 (日) 09:21:43 - G25 切り口は1塩基の3’突出なので、ポリメラーゼ活性で埋め戻すことはできません。 3’突出をT4 DNA pol あるいはKlenow、あるいはPCR用の校正活性のある耐熱性ポリメラーゼ(KODなど)で削ることになります。T4 polが使われることが多いですが、3’ exonuclease活性が高いので、削すぎ(3‘陥没)を生じないようにコントロールすることが肝要です。 1塩基欠失より、inverse PCRでもしていらない遺伝子をごっそり欠損させる方がいいと思います。 1塩基欠失だと、途中でフレームシフトしているとは言え、発現したら思わぬ悪さをしかねない(dominant negativeとか異常タンパク質の凝集とか)。 inverse PCRだとプラスミド全長のシークエンスの確認が不可欠になりますけど。

プラスミド上の遺伝子をつぶす 削除/引用 No.12673-1 - 2024/11/10 (日) 04:22:07 - 通りすがり 　クローニングにあまり慣れていなくて、基本的な質問があります。 　今の自分の実験系で必要な遺伝子等が各種すべて入っている良いプラスミドを見つけたのですが、どうしてもあっては困る遺伝子も一つ入ってしまっています。 　その遺伝子の配列の中に、EcoNIサイトがUnique cutterとして入っています。そこで、EcoNIで切った後に、一塩基の突出部分をKlenowで塞ぐか、T4 DNAポリメラーゼで切断し、フレームシフトを目指してBluntでつなぐということを素人なりに考えました。 　直感的にはできそうな気がするのですが、これは現実的に可能だと思われますでしょうか。詳しい方のアドバイスをいただければ幸いです。

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