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(無題) 削除/引用 No.12668-7 - 2024/11/07 (木) 00:54:14 - WBS みなさまありがとうございます。プロトコール作りの参考にします。

(無題) 削除/引用 No.12668-6 - 2024/11/06 (水) 12:17:48 - 1 SDS-sample bufferに溶解した状態で（boilingなし、還元剤なし）数本に分注して-80℃に保存してます。(SDS-bufferなしでの凍結保存はproteinase inhibitorがあっても凍結融解時などにproteinaseによるタンパク質の緩慢な分解が危惧されるのでしてません。) 凍結サンプルは使用する時に融解して還元剤を添加してboilingしてます。貴重なサンプルでない限りは余ったら捨てます。添加した還元剤は時間経つと効果が低下してきてタンパク質のシステインが徐々に再酸化されて泳動パタンが変わったり、スメアーになったりすることがあるので、還元剤入れた状態での長期の保存はしないほうがいいと思います。1週間くらいなら別にいいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12668-5 - 2024/11/06 (水) 10:06:08 - あの ちなみに分注して凍結保存する際には、通常グレードのマイクロチューブで問題ないですが、 ボイルでは低級着グレードを使った方が良いです。明らかにバンドの強さが違います。 ボイルしてから凍結する人って、　分注にはどのグレードのマイクロチューブを使っているのでしょう？

(無題) 削除/引用 No.12668-4 - 2024/11/06 (水) 08:32:29 - あの 組織サンプルを、ロシュのプロテアーゼインヒビタ混合剤を溶かしてTperで抽出した後に分注してマイナス８０度で凍結保存しています。　半年程度の保存は問題ないです。 抽出サンプルの一部を用いてBCAアッセイでたんぱく濃度測定しておきます。 泳動する日に、あらかじめ計算しておいた比率でボイルして泳動です。 インヒビタがあるから酵素による消化はないだろうという考えです。 もしかしたら膜タンパクなどは、分子量からの推定移動度と実際の移動度のズレが生じやすいかもしれませんが。 ボイルしてから凍結保存する人って　分注はどのタイミングでするのか興味あります。

(無題) 削除/引用 No.12668-3 - 2024/11/06 (水) 06:52:44 - WBS >[Re:2] おおさんは書きました : RIPA bufferを使っており、SDSPAGE以外の実験はしません。 と言いますと、プロテインの濃度を測定し、サンプル間での濃度を合わせて、そこに色のついているサンプルバッファーと還元剤を混ぜておいて保存する。泳動するときに溶かしてGelにロードする。 このような感じでしょうか

(無題) 削除/引用 No.12668-2 - 2024/11/06 (水) 05:50:25 - おお どんなLysis bufferなのか、SDSPAGE以外の実験を考えているのかなどで変わってくると思いますが、Lysatesを取ったらその日のうちにサンプルバッファー処理したほうがより良いと思ってます。SDSなどで変性させるわけだからプロテアーゼとかなにか内在性のサンプルに影響を与える酵素を不活性化できるからです。 サンプルバッファーを加えないで保存した場合、溶かすのに時間が掛かるしその間も蛋白に何らかの酵素が作用している場合もあります。サンプルバッファー処理して保存してた場合はボイルはほど極端なことはしませんが５０度ぐらいで溶かしたりしてます。 もちろんLysis buffer中で凍結保存するのがだめとまで言いません。

ウエスタンのプロテインサンプルを取っておく場合 削除/引用 No.12668-1 - 2024/11/06 (水) 04:48:52 - WBS いつも勉強させてもらってます。 ウエスタンでプロテインを電気泳動する前はどの状態で保存していますか？ 当方はサンプル間の濃度とロードする量を揃えて-80で保存し、 泳動当日にサンプルバッファーと還元剤をそれぞれのチューブに入れてボイル、泳動をしています。 人によってはボイルまでしてフリーズ保存して、別日に（そのまま？再びボイルしてから？）泳動するという人もいると見聞きます。日によっては忙しい場合もあるので、いくつかプロトコールを知っておきたいと思います。みなさんのご経験を聞かせてほしいです。よろしくお願いします。

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