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(無題) 削除/引用 No.12667-15 - 2024/11/06 (水) 14:41:12 - たまご AAさん、ご紹介ありがとうございます。 Immpact vector redの方は感度も高そうでとても良さげですね。 FISHに適用すると実際どうなるか分かりませんが、反応が20-30分で終了するというのも魅力的です。

(無題) 削除/引用 No.12667-14 - 2024/11/06 (水) 13:45:21 - AA 私も昔からRocheのfastredを使っていて同じ悩みを持っています。 知人に聞いたらvectatainのvector blueやvector red(Immpact vector red)が使えないこともない、と言われました。 私自身はちょっとまだ試せていませんが、AP基質で代替できうる既製品としてはこのあたりでしょうか・・・

(無題) 削除/引用 No.12667-13 - 2024/11/06 (水) 12:58:44 - たまご NBT/BCIPについて、ありがとうございます。 近赤外蛍光なのですね。勉強になります。Alexa647の設定で、明視野と同時に撮影してみようと思います。 Nacalai tesqueのReady-to-useの基質溶液はトルイジン塩なので良いかもと思いました（調製不要で安そうです）。

(無題) 削除/引用 No.12667-12 - 2024/11/06 (水) 02:57:55 - あの こういう先人の経験も見つけましたので貼っときます 　https://anatomy.med.gunma-u.ac.jp/protocols/?p=36 共焦点顕微鏡使って、Alexa647用の設定で自分ならためしてみます。

(無題) 削除/引用 No.12667-11 - 2024/11/05 (火) 22:26:37 - G25 NBT/BCIPは古典的なAPの発色基質ですね。それがある波長では蛍光染色としても使えるという報告があるということですね。通常よく使われるのレンジより長波長域なので装置を選ぶかもしれないという点と、元々発色基質ですので、色素によってカウンターステインなどがクエンチングや干渉を受けるかもしれないという点で適用に制限があるかもですが面白い知見です。 脇道にそれるけど、 リンク先のBCIP製品はみんなナトリウム塩なのね。 もし購入するならトルイジン塩をお勧めします。 ナトリウム塩は水に溶かして、トルイジン塩はDMFに溶かしてストック溶液としてフリーザーで保存しますが、ナトリウム塩の水溶液は短期間で自発反応して勝手に発色してしまいます。つまり劣化が迅速。

(無題) 削除/引用 No.12667-10 - 2024/11/05 (火) 21:35:28 - たまご あのさん 基質溶液を自作する方法は初めて知りました。大変参考になります。ありがとうございます。 G25さん 製品レベルで言うとやはり無いんですね。組織に定着させるのが難しいと言うのは初めて知りました。とりあえずFastRedが手に入るまでの間は、手近で試すことができるところから色々試してみようと思います。 お二人とも知恵をお貸しいただき大変ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12667-9 - 2024/11/05 (火) 21:22:54 - G25 免疫組織染色で使えるAPの蛍光基質はFast Red TR/Naphthol AS-MX くらいしかないと思う(かつてはHNPPがavailableだった)。あるなら私も知りたい。 十分な蛍光強度を持ち、かつ反応産物がin situで組織標本に定着する基質がなかなかないそうで。

(無題) 削除/引用 No.12667-8 - 2024/11/05 (火) 21:12:12 - あの 次を参考にすると自作もできる(？) https://bizcomjapan.co.jp/iris-biotech/products/biochem-molbio-tools/reporter-enzyme/ap/

(無題) 削除/引用 No.12667-7 - 2024/11/05 (火) 21:03:38 - あの 次のキーワード二つで、Google検索すると　色々出てくるけど、、、 　アルカリフォスファターゼ 　蛍光基質 あいにく当方は使用したことは無いですが。

(無題) 削除/引用 No.12667-6 - 2024/11/05 (火) 19:50:08 - たまご ご回答ありがとうございます。 あのさん おっしゃる通りanti-sheep antibody-Cy3というものを試してみようかとも考えているのですが、G25さんのご回答と同じような意見を耳にしまして心配しているところでした。また、AP標識についてはanti-DIG ab-APで可能なのですが、肝心の基質が見つかっておらず悩ましいところです。 G25さん おっしゃる通り普通の抗体染色では感度が足りないだろうという話を耳にしました。やはりanti-DIG-POをTSAで検出するのが一番無難でしょうか。 （プローブ変更と抗体の買い替えを余儀なくされるのでなかなか踏ん切りがつかないという次第です、、） TSA検出のプロトコルを共有していただきありがとうございます。大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.12667-5 - 2024/11/05 (火) 19:24:26 - あの アルフォス標識に限定なら、抗ヒツジIgG抗体でアルフォス標識されたもので、その既に持っている抗dig抗体に結合させるとか。

(無題) 削除/引用 No.12667-4 - 2024/11/05 (火) 19:08:13 - G25 AP-Fast Res/HNPP（今はなき国産開発品）とPO-TSAによる二重蛍光ISHの紹介 https://jfly.uni-koeln.de/html/manuals/pdf/J_fluorescent_in_situ.pdf

(無題) 削除/引用 No.12667-3 - 2024/11/05 (火) 19:01:24 - G25 抗体の直接蛍光標識では感度が足りないでしょう。 酵素反応を噛ませることで増幅がかかるのがミソですから。 それとも、最近は光学系の進歩でそういう微弱蛍光でも見えるようになった？ SIGMAFASTの入荷は3ヶ月待ちみたいですね。 anti-DIG-POにしてTSAで検出するというのは？

(無題) 削除/引用 No.12667-2 - 2024/11/05 (火) 18:46:09 - あの 直接の回答ではありませんが、 適当に、抗ヒツジIgG抗体で、お好きな標識されたものから選んで、第二抗体として使うのはダメですか？

in situ hybridizationの蛍光検出試薬について 削除/引用 No.12667-1 - 2024/11/05 (火) 15:51:24 - たまご いつも参考にさせていただいております。 現在、ショウジョウバエ組織にて蛍光in situ hybridizationに取り組んでおりますが、その検出試薬であるFast Red TR/Naphthol AS-MX (sigma, F4648)の代替品を探しております（欠品していてなかなか手に入らず困っています）。 現状は、RNAプローブのUTPをDIGで標識しており(Roshe, #11175025910)、抗体には抗DIG抗体-アルカリホスファターゼ（sheep, #11093274910）を使用しております。 基質やメーカーは問いませんが、１、DIGを（可能ならAP反応で）検出できること、２、蛍光で検出できることを指標に探しています。 もし何かご存じの方がいらっしゃいましたら、ご教授願えればと存じます。 何卒よろしくお願いいたします。

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