全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12662-14 - 2024/11/05 (火) 13:19:26 - 3 PFA固定以外の固定方法に変えてみてはどうでしょうか。冷メタノールや冷アセトンで劇的に変わることがあります。ていうかPFAなどアルデヒド系固定では染まらなくて、未固定凍結切片で有機溶媒固定の時のみ綺麗に染まるケースも経験あります。

(無題) 削除/引用 No.12662-12 - 2024/11/01 (金) 14:14:59 - みみ G25様 返信が遅れてすみません。私自身がペプチド配列を選択したわけではないのですが、その微生物抗原の生理活性がありそうな部分を３箇所ピックアップしてもらい、３種類のペプチドに対する抗体を産生するクローンを選択したのですが、なかなかトリッキーですね。色々抗原賦活の方法を変えてみて、ダメな場合は全長タンパクで免疫の方が良さそうでしょうか... 774R様 確かに、その部分に変異が入っていたりすると認識するのが難しくなりそうですね。ただ、その微生物に感染している(と思われる)患者血清のELISAで、私たちの合成した微生物ペプチドに対する抗体は検出されたので、使えない配列ではなさそうなのですが、免疫染色で使えるかどうかは別問題なのかなと思いました...

(無題) 削除/引用 No.12662-11 - 2024/11/01 (金) 13:51:34 - 774R >微生物から抽出するのが難しく、既知のアミノ酸配列からピックアップしてペプチドを合成したものになります。 やはり。となると、そのペプチドが現在扱ってる菌に実在するかどうか未知かもしれないと。

皆様ありがとうございます 削除/引用 No.12662-10 - 2024/11/01 (金) 13:44:39 - みみ 抗原認識様 確かにその通りですね。現在全長のタンパク質も入手できないか模索中なので、最悪そちらで免疫しなおしてみるという手もありそうです。ありがとうございます。 toto様 尿素で抗原賦活したことはなかったのですが、試してみる価値はありそうですね。ありがとうございます。 774R様 微生物から抽出するのが難しく、既知のアミノ酸配列からピックアップしてペプチドを合成したものになります。

(無題) 削除/引用 No.12662-9 - 2024/11/01 (金) 13:38:54 - G25 ペプチド配列はどうやって選んだのでしょうか。 タンパク質表面に曝露しない領域や、そもそもエピトープになりにくい配列があったりするので、ペプチド抗原は当たり外れが大きい。 ペプチド配列の選択にはそれなりのノウハウが必要ですが。 タンパク質の立体構造の内側にあって抗体がアクセスしにくい配列である場合「抗原の賦活化」で解決する可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.12662-8 - 2024/11/01 (金) 13:19:44 - 774R >微生物のペプチドを認識することはELISAで確認しております。 これについて確認させてください。そのペプチドは微生物から抽出または精製したものですか？　それとも想定するペプチドを化学合成したものですか？

(無題) 削除/引用 No.12662-7 - 2024/11/01 (金) 13:04:21 - toto ELIZAでペプチドに反応するが生体サンプルでは反応性が見えない、ということはエピトープが外に出てないか、そのペプチドが修飾されているか、でしょう。賦活化をいくつか試されても反応性が出ないのならば、前者の可能性は下がりますが、念のために、たとえばさらにしつこく７Ｍureaくらいで数分間処理してみるとか。修飾されてるのであれば、そのペプチド配列は免染には使えない可能性が高いので、さっさと他の配列を選んだほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.12662-6 - 2024/11/01 (金) 12:57:47 - 抗原認識 抗体には一次構造（配列）認識抗体と立体構造認識抗体が存在します。 組織切片中のタンパクは立体構造を持つため、 ELISAやWB（直鎖）にて検出可能な一次構造（配列）認識抗体では、 立体構造を認識できず検出できないことは多々あります。 特にペプチドを免疫源に使用する場合はあり得ることです。 このため、組織染色での成功の可能性を上げるため、 抗原の全長を用いて免疫することも多いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.12662-5 - 2024/11/01 (金) 12:47:29 - みみ siRNA様 凍結、パラフィン固定、各種免疫賦活方法、抗体濃度など色々振ってやってみたのですが、どうしても染まらないのです。。。 う様 マウスのモノクロ抗体なので、微生物のペプチドに対して抗体産生性の高いクローンをELISAでピックアップしました。 774R様 作成した抗体が、微生物のペプチドを認識することはELISAで確認しております。微生物由来成分が存在するポジコンの組織としては、今は入手不可能な別の抗体で陽性を確認したサンプルを使用しています。ただ、本当にポジコンとして適切なのか（サンプル中に抗原が本当に存在するのか）はウエスタンなど他の方法でも確かめておいた方が良いのかなと考えております...

(無題) 削除/引用 No.12662-4 - 2024/11/01 (金) 12:38:50 - 774R 「微生物由来成分」は染めようとする組織に存在するのか？ 抗体が「微生物由来成分」に反応することはどのように確かめたのか？

(無題) 削除/引用 No.12662-3 - 2024/11/01 (金) 12:32:05 - う その６種類の抗体をどうやって選んだのか

(無題) 削除/引用 No.12662-2 - 2024/11/01 (金) 12:29:06 - siRNA 固定方法、抗原賦活化など試してみることはいくつかあります。

免疫染色用抗体の作成 削除/引用 No.12662-1 - 2024/11/01 (金) 10:27:26 - みみ いつも参考にさせていただいております。 マウスを微生物由来成分で免疫して、微生物に対するマウスモノクローナル抗体の作成を行なっています。 組織染色で使用したいと考えておりますが、いくつかのクローンを樹立しさまざまな方法で染色しているのですが、一向に染まりません... 当方、免疫染色に関しては習熟しており、染色手技の問題ではなく抗体自体の問題ではないかと考えておりますが、免疫染色に利用できる抗体作成というのはかなり難しいものなのでしょうか？ 6種類くらいのクローンで作った抗体で試していますが、数十個の別のクローンでも試すべきか、もしくはマウスの免疫に使用するペプチド自体の配列を変更した方が良いのか、迷っております。 ちなみに、ウサギのポリクローナル抗体も作成しましたが、全く染色できませんでした.... 有識者の方のご意見をお伺いできれば幸いです。

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---