BioTechnicalフォーラム [WBのマーカーが不正確]

WBのマーカーが不正確

No.12659-TOPIC - 2024/10/31 (木) 12:40:08 - 通りすがり

過去におそらく同じようなトピックがあったとは思うのですが、、、

　WBでPrestained（青）のマーカーを使っているのですが、一つだけでなく、様々な抗原を染めて見ても、一貫して予想より10 kDA強大きい位置に出ます。言い換えると、マーカーが常に必要以上に速く流れている感じです。

１：分注していないで凍結融解を繰り返しているからか？それにしては、バンドはぼやけずシャープ。

２：マーカーとサンプルが違うバッファーに溶けているからか？ただ、以前にはここまで気になるような差はなかったように思う。

　などなどと思い悩んでいます。原因及び、対策などがあればご教授いただけますでしょうか。
　

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No.12659-7 - 2024/11/01 (金) 01:17:14 - 通りすがり

皆様、コメントありがとうございます。

大変恐縮なのですが、自己解決したかもしれません。ラボではNuPageのシステムでゲルやバッファーを統一していまして、マーカーもInvitrogen系なのですが、推奨のゲルリストに、当方使用のものがありません。さらに、このマーカーに（ラボの誰かが）切り替える前に使っていた、以前のマーカーの推奨リストには、当方使用のゲルが載っています。

ｑｑさんのおっしゃるように、他のマーカーと一緒に流せば、確かめられるものと思います。

大変お騒がせいたしました。

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No.12659-6 - 2024/11/01 (金) 00:20:59 - おお

>[Re:1] 通りすがりさんは書きました :
> 過去におそらく同じようなトピックがあったとは思うのですが、、、
>
> 　WBでPrestained（青）のマーカーを使っているのですが、一つだけでなく、様々な抗原を染めて見ても、一貫して予想より10 kDA強大きい位置に出ます。言い換えると、マーカーが常に必要以上に速く流れている感じです。
>
> １：分注していないで凍結融解を繰り返しているからか？
>

それを疑うのなら、購入直後と比べてという事だと思いますが、、、
> ２：マーカーとサンプルが違うバッファーに溶けているからか？ただ、以前にはここまで気になるような差はなかったように思う。
>

その以前というのは同じマーカーでの話ですか？それならロット差もあるのでメーカーに問い合わせしてみてもいいのかも。あるいは、マーカーによっては色素の着き具合によって大きさが変わるのでロットおきにサイズが違い購入時に付いてくる添付文書にそのロットの情報が書かれている事がある。

バッファーの違いでどの程度差が出るかはよく分からないですが、サンプルの塩濃度が高ければ泳動は遅れ気味になる。
あるいはゲルの両端は熱がこもりやすく(？)、早く流れがちだけど、大抵はバンドがなったりでわかりそうだが、、、回避するなら電圧を落としてゆっくり流すと言う対処法もあると思う。

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No.12659-5 - 2024/10/31 (木) 18:43:00 - qq

他の部屋に頼んで、別のマーカーを一緒に流してみて相互比較するのはいかがでしょうか？
マーカーのせいなのか、それともそれ以外の問題なのか分かるんじゃないでしょうか？

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No.12659-4 - 2024/10/31 (木) 17:03:35 - おお

低分子領域のマーカーは、メーカー間でのブレが結構ある。また、今はゲルや泳動のバッファーもバリエーションがあり、マーカーのサイズをどのバッファーシステムで決めたのかと言うのもあると思う｡それと違うバッファーでは移動度がかわる可能性｡

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No.12659-3 - 2024/10/31 (木) 13:23:25 - 通りすがり

InvitrogenのBenchMark Pre-stained Protein Ladder、 cat#10748010です。

どのということはなく、全体的に10kDa以上、シフトしている感じです。