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(無題) 削除/引用 No.12653-11 - 2024/10/29 (火) 20:51:12 - 3 そこまで正確な分子量にこだわる理由はなんでしょうか。SDS-PAGEは極めて簡便に比較的理論値に合う分子量が示されることが多い方法として汎用されているのであって、あくまで見かけの分子量であり、もともと厳密にわずかな分子量の変化を捉えて定量的に議論するような実験法ではありませんし、もしそこまで必要ならば別の方法で、ということになります。SDS-PAGEの示す分子量は、まあだいたいそのくらいで理論値からそれほど外れていない、という感じで、アミノ酸組成などによってはSDS-PAGEの示す分子量が理論値と大きく異なることもあります。 なので方法上の限界を考えるとSDS-PAGEで85KDaか95KDaかを悩むこと自体どんなものかなあと思いました。 有色分子量マーカーもたとえば75KDaのマーカーもメーカーによって異動度は異なることはしばしばあるし、正確な分子量推定は無理と説明に書いてあることもあります。（分子量をある程度厳密に推定したいなら未着色マーカーの方が良い） 正確な分子量測定については昔はTOF-MASSとか使って調べる方法もありましたが、分子量の小さいタンパク質向きで、大きいのは難しいように思います。

(無題) 削除/引用 No.12653-10 - 2024/10/29 (火) 19:56:25 - TS 他の方のご意見がごもっともと思うのですが、 もし可能でしたら、なぜ分子サイズを正確に計算したいのかをお示しすることは可能でしょうか。 ゲルの移動度では限界があると私も思いますが、目的によっては他に適したアプローチがないのかなと思いました。 抗体の特性性を確認するためではないですよね？

(無題) 削除/引用 No.12653-9 - 2024/10/29 (火) 19:54:28 - qq ＞もしかしたら、、、、見つかりませんでした。 期待するようなソフトの機能は、ImageJで実行できるでしょう。（analyse>curve-fittingの辺りです）詳細は、ネットで説明するのも面倒なので、ご自分で努力するか、誰かを探してください。 全てのバンドは幅があるけれどどこを指定するつもりでしょうか？ Precision Standardは、色素のついていないマーカーもあると思います。 マーカーの分子サイズは、基本的にはnon-colorのマーカーのサイズだと思いますが、実用的にcolorマーカーも同じ値で使われていると思います。 更に、カラーマーカーは幾分バンドが太くなってしまいます（precision Standardはそこそこシャープだと思いますが、、）。 そんなわけで、どうやっても正確な分子量が得られるわけではないのです。 それでも、一定の誤差範囲に再現的に値を得ることができるかもしれませんから、努力しても悪くはないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12653-8 - 2024/10/29 (火) 19:03:12 - おお https://www.labxchange.org/library/items/lb:LabXchange:02a2a79b:html:1 II. Estimating molecular weight 移動度から分子量を計算する方法はありますが、その数字が持つ意味という点では指摘されている通りです｡それでも数字を当てたいと思うなら、計算すればいいでしょう｡それは何を言わんとするかなどによると思います｡

(無題) 削除/引用 No.12653-7 - 2024/10/29 (火) 17:36:39 - う 糖鎖込みで正確な分子量が必要な理由を知りたい。糖鎖ってヘテロだし。

(無題) 削除/引用 No.12653-6 - 2024/10/29 (火) 17:27:27 - G25 糖鎖にはSDSが抱合しない、あるい抱合してもタンパク質とは割合が違う、 糖鎖はペプチド鎖に対して側鎖。枝分れ構造なので単純な線形ではない。 ペプチドだけなら鎖長と分子量がほぼ比例とみなせるが、 ペプチドと糖鎖じゃパラメータは違うだろう。 また、糖鎖の長さや分岐などは多様雑多で、一義的には決まらなかもしれない。 ということで、WBでやるのは難題だと思います。 やはり、当該タンパク質を単離精製して糖鎖分析するしか、、、、

(無題) 削除/引用 No.12653-4 - 2024/10/29 (火) 16:45:14 - 独り言 たぶん、泳動だけから正確な分子量を測定することを難しいと思う。 例えば75kDaのマーカーと一緒に、75kDaの目的タンパク質を泳動しても、75kDaと異なる位置に出たりもします。 なぜなら、マーカーの位置が100％は正しくない可能性があります。 マーカーには色素がついているため、その分、分子量が少し増えるし、マーカーも何らかのタンパク質を用いているはずですが、その＋またはーのチャージの数によって、同じ分子量でも異なるアミノ酸配列であれば移動度は異なる場合があります。 そもそも、なぜ正確な分子量が知りたいのでしょうか？ 勝手な想像ですが、例えば、目的タンパク質の一部アミノ酸配列が欠損とかを予想しているのであれば、目的タンパク質をプラスミドなどから外来的に発現させて、全く同じ位置に検出されるを調べれば、ある程度わかります。

(無題) 削除/引用 No.12653-3 - 2024/10/29 (火) 16:43:48 - あ ゲル→メンブレン

(無題) 削除/引用 No.12653-2 - 2024/10/29 (火) 16:42:40 - あ ゲルを写真に撮ったのち、ウエルからマーカーのバンドまでの距離を測って（ピクセルでもcmでもいいので）、片対数グラフにプロットすれば、分子サイズを計算できます。古典的な方法です。 ImageJ/Fujiなどのソフトウエア上で、スキャンしたゲルの写真を使ってできます。 精度は高くないのと、あくまでSDS-PAGE上の分子サイズです。

WBでマーカーからのサイズの予想を出来る限り正確に行いたい 削除/引用 No.12653-1 - 2024/10/29 (火) 16:09:30 - マーカー ウェスタンブロットで、検出したバンドのサイズがマーカーのサイズとは違う場合に、バンドのサイズを出来る限り正確に知る為にはどのような方法があるでしょうか？ 私が研究しているタンパクは計算上のサイズは75kDaなのですが、N'-Glycosylationの為、ウェスタンブロットを行うと90kDa程度にバンドが見られます。Deglycosylationを行うとバンドが75kDaのところにシフトするので間違いないと考えられます。 さて、上で90kDa程度と書きましたが、これはかなり不正確だと思われます。私が使っているマーカー(バイオラドのPrecision Rainbow Marker)は100kDaと75kDaのバンドが出るので、この二つのマーカーバンドの間、真ん中より少し上にタンパクのバンドが出るので、まあ90kDa程度だろうと見積もっています。実際には95kDaかもしれないし、85kDa程度かもしれません。 このような場合、自分の研究しているタンパクのサイズの計測はどのように行うのがベストでしょうか？ intact massを行えば？という話は出たのですが、必要なタンパクの量が多すぎてちょっと準備出来そうにないので却下となりました。ウェスタンブロットの図から予測出来ればと思っています。 もしかしたら「マーカーレーンの各サイズのバンドの位置をプロットして直線を引いて、着目しているタンパクのバンドの位置と、ゲルの濃度（グラジェントを使ってます）をパラメーターとして入れると、タンパクサイズを予測してくれる」ようなソフトウェアなんかがないかと思って探してみたのですが、見つかりませんでした。 このような場合に皆様はどのようにされているか、教えて頂けると有り難いです。よろしくお願いいたします。

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