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(無題) 削除/引用 No.12653-31 - 2024/11/05 (火) 14:52:45 - う 最初の質問の趣旨が、ゲル上のサイズをなるべく正確に測りたいということなので、オーバーロードでバンドがぼってりになった時にどこを測るかというよりは、バンドが細くなるように流して計った方が良いと思うのです。 オーバーロードでバンドがぼってりになったら、アプライ量を減らしてもう一度やり直しましょう、というのが私の意見ですが、バンド（クロマトグラム）は台形になっているようと思います。私はサイズを測るのが目的ならこの出るでは計りません。絡むつもりはないです、念のため。

(無題) 削除/引用 No.12653-30 - 2024/11/05 (火) 02:23:06 - おお >[Re:28] うさんは書きました : > 電気泳動上のサイズをなるべく正確に測りたいなら、細くシャープなバンドになるようにアプライ量を減らして流してマーカーと比較すればよくて、それなら上でもピーク位置でも下でも同じになるでしょう。 それはシグナルが高いピークを取っているのと同等ですよね。 そのうえで、 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/srp6312 こちらのような泳動パターンのときに化学発光で検出した場合ピークは同じ位置に来るでしょうか？ 測り方が間違えているとは言ってません。ある意味現実的だとは思います。でも検証はしたほうが良さそうだとということです。それとも検証したというデーターがあるならリファレンスをください。あるいは同じぐらいのシグナルになるように量を調整するか（ただし全体のタンパク量も影響する可能性が不安材料です）。 > そもそも電気泳動上のサイズは、測定の分解能が低いし、タンパク質の分子量と正確には一致しないからあんまり意味ないですけどね。 >[Re:27] マーカーさんは書きました : > おおさんとのやり取りは、バンドの移動度を計測する際にバンドの上部を取るのと、バンドのサイドの一番膨らんだところ（理屈的には輝度の一番高い位置と同じになるはず）を取るのと、どっちの方がより正確なバンドの移動度を反映しているのか、で議論しているつもりです。が、おおさんが同じ考えなのかどうはかわからないです。 そういうつもりです。

(無題) 削除/引用 No.12653-29 - 2024/11/01 (金) 23:44:27 - 774R たとえば精製したタンパク質をSDS-PAGEしてゲルをCBB染色すると、レーンによってタンパク量に違いが出ますが、タンパク量の多いレーンを見ると、バンドが下に膨らみますね。なので、本来の位置はバンドの上の方です。DNAだと逆にバンドが上に膨らみますね。

(無題) 削除/引用 No.12653-28 - 2024/11/01 (金) 23:39:05 - う 電気泳動上のサイズをなるべく正確に測りたいなら、細くシャープなバンドになるようにアプライ量を減らして流してマーカーと比較すればよくて、それなら上でもピーク位置でも下でも同じになるでしょう。私はピーク位置で測りますけど。 そもそも電気泳動上のサイズは、測定の分解能が低いし、タンパク質の分子量と正確には一致しないからあんまり意味ないですけどね。

(無題) 削除/引用 No.12653-27 - 2024/11/01 (金) 13:37:06 - マーカー >うさん >この人結局何が知りたいのか。 トピを上げた時に知りたかったのは、100kDaと75kDaの間にあるバンドの大きさは何kDaと見做せるのか？でした。これは、あさんやおおさんのレスにある、バンド、タンパクの移動度から分子量を計測する方法が答えでした。なので、基本的には知りたいことに関しては既に答えを頂いている状態です（皆様ありがとうございます）。 で、更に、その方法で計測したところで正確な分子量とは言えないですよ、という助言も頂いている状態です。こちらも有用な話で有り難いです。 おおさんとのやり取りは、バンドの移動度を計測する際にバンドの上部を取るのと、バンドのサイドの一番膨らんだところ（理屈的には輝度の一番高い位置と同じになるはず）を取るのと、どっちの方がより正確なバンドの移動度を反映しているのか、で議論しているつもりです。が、おおさんが同じ考えなのかどうはかわからないです。

(無題) 削除/引用 No.12653-26 - 2024/11/01 (金) 12:32:52 - う この人結局何が知りたいのか。

(無題) 削除/引用 No.12653-25 - 2024/11/01 (金) 05:45:50 - マーカー >おおさん やはり、イマイチおおさんの主張がわからないです。 >上を取るとずれるように思うとリンク 実際ズレてますよね？おおさんの助言に従って上を取っていれば、同じタンパクでもゲルにアプライした量が違うだけでサイズの異なるタンパクというデータが出来上がってしまいます。 >それに最初は正確なサイズとおっしゃっている おおさんからの「まちがってます」で始まるレス（No.12653-17）より前にNo.12653-15に書いた通りで、「そこまで正確に計測したい訳ではなかったのです」。 その上でですが、正確に計測したところでそれはあくまでWB上でのサイズに過ぎず、実際のサイズを正確に反映したものでは無いだろうことは、おおさんも指摘されてますよね？この実験系で正確に計測したとしても正確なサイズが測れる訳ではないことは、そこまでの（おおさん含む）皆さんの指摘でハッキリしてると思います。なのですが、バンドの上をとるかサイドの一番膨らんだところを取るかの違いで「"なら"正確なサイズって測れる？」と聞かれる理由がわからないです。 >理想的な状況でない理由でプラクティカルにそうするというのはわかりますけど それ以上の何ができるんでしょうか？完全に正確とは言えないが、その状況下でのベストと考えられる方法でやりました、以上の何をしろと？ >それと正確な移動度を反映しているかどうかは別ですよね。 既にそういう指摘をG25さんはじめ多くの方から頂いており、また私もそれに反対するものでも無いです。私、そんな態度取ってましたかね？ ただ、バンドの上をとるのはどう考えても無いな、と思ったのでそれは実際の例を出して反論させて頂きました。この点に関してはおおさんも納得されてると思います（もしかして納得なんてされてませんか？）。そして、うさんの指摘にある「輝度のピーク位置」を取るというのに私は納得していますが、おおさんは、これも間違いである、と言っているということですか？バンドの位置をとることは出来ないと考えるのが妥当、とか。そういうことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12653-24 - 2024/11/01 (金) 03:05:05 - おお >[Re:23] マーカーさんは書きました : > >おおさん、うさん > ありがとうございます。 > > >なら正確なサイズって測れる？ > なら、の意味がイマイチわからないのですが（正確ではなかろう理由が他にたくさんあるなかで、バンドの上か真ん中を取るかでのズレ程度がクリティカルな話になろうはずも無いし）、 上を取るとずれるように思うとリンクをつけていてこの主張は矛盾しませんか？それに最初は正確なサイズとおっしゃっているし。 >うさんのレスが答えになってると思います。私も「サイドの一番膨らんだところ」が取りにくければ、うさんのレスに沿ったやり方をするつもりでした。 理想的な状況でない理由でプラクティカルにそうするというのはわかりますけど、それと正確な移動度を反映しているかどうかは別ですよね。

(無題) 削除/引用 No.12653-23 - 2024/11/01 (金) 00:47:39 - マーカー >おおさん、うさん ありがとうございます。 >なら正確なサイズって測れる？ なら、の意味がイマイチわからないのですが（正確ではなかろう理由が他にたくさんあるなかで、バンドの上か真ん中を取るかでのズレ程度がクリティカルな話になろうはずも無いし）、うさんのレスが答えになってると思います。私も「サイドの一番膨らんだところ」が取りにくければ、うさんのレスに沿ったやり方をするつもりでした。 >G25さん >95 kDaかもしれないし85 kDaかもしれないという程度の精度しかないのだとしたら、そのあたりの分子量の分離や解像度が良くないからではないですか。着目している範囲がよく分離するようにゲル濃度を下げるなどして工夫してみては。 仰る通りで、現在使っているゲルが4-12%のもので、90kDa前後を見るには3-8%の方が適当かなと思いました。ただ、それでも劇的に結果は変わらない（どっちにしろ大した精度は得られない）かなと思います。残念ですが。どのみち、他の指摘にもあるように正確さを期待できる実験系ではないので、あまりこだわり過ぎても仕方が無いかなとも思っています。 >糖鎖を除去すると理論値と矛盾しない75 kDaのバンドが検出される。 糖鎖が付いたインタクトな状態では、「90 kDa付近にバンドが検出される」。 正確な分子量はもとまらなくても、あるがままの事実を記載すれば十分だと思います。 そうですよね。仰る通りの事実を記載して、その上で、N'-Glycosylationのconsensus sequenceがX個含まれている、の記述を足す程度にするのが無難だろうと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12653-22 - 2024/10/31 (木) 17:50:50 - G25 その糖タンパク質のバンドの移動距離が正確に測って、それを検量線に当てはめて何kDaにあらるかを求めるとう作業はあたりまえのことでそんなに難しくない。 もし、今、95 kDaかもしれないし85 kDaかもしれないという程度の精度しかないのだとしたら、そのあたりの分子量の分離や解像度が良くないからではないですか。着目している範囲がよく分離するようにゲル濃度を下げるなどして工夫してみては。 あるいは本当に95 kDaから85 kDaまでバンドが広がっているのかも。 糖鎖はヘテロだし、糖タンパク質の泳動像はシャープにフォーカスしたバンドじゃなくてボケて広がりがち。 そういう技術的な問題をクリアして、 ちゃんと移動距離が正確に測定できて検量線が引けて、 問題のタンパク質のバンドがその検量線に当てはめると90 kDaになったとしても、 「この糖タンパク質の分子量は90 kDaである（と推定される）」とは書けないですよ。SDS-PAGEは糖鎖付きのタンパク質も単純タンパク質と同じパラメータで移動するというものではないですうから。 糖鎖を除去すると理論値と矛盾しない75 kDaのバンドが検出される。 糖鎖が付いたインタクトな状態では、「90 kDa付近にバンドが検出される」。 正確な分子量はもとまらなくても、あるがままの事実を記載すれば十分だと思います。

(無題) 削除/引用 No.12653-21 - 2024/10/31 (木) 17:14:48 - う スキャンした輝度のピーク位置じゃないですかね。SDS -PAGEはゲル濾過のようなものですし。 上で測るか、下で測るかは写真やゲルを直接定規で測るときのことだと思いますけど、ImageJとかでスキャンすればチャートになるので、そのピーク位置を測れば良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.12653-20 - 2024/10/31 (木) 13:19:59 - おお あ、そうか。発光を見ているのでシグナルが強くなるとバンドの位置より外にシグナルが広がるのか。なら正確なサイズって測れる？

(無題) 削除/引用 No.12653-19 - 2024/10/31 (木) 11:47:24 - マーカー >おおさん >基本的にバンドの一番上のところまでの距離を図ります。 これ、本当にそうなんでしょうか？示されたリンクの図では確かにそうですが、なんか、こんな上辺が切り取られたみたいな形のバンドは珍しい部類じゃないでしょうか？ 実際に私が普段行っているウェスタンブロットでは、シグナルの強さが2倍とか3倍になる場合でも、「量が多くなるにつれて下に太って」いってるようには見えないです。 ttps://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/phospho-stat3-tyr705-d3a7-xp-rabbit-mab/9145 （すいません。何故か直リンクを拒否されたので、hをつけてコピペしてアドレスバーに入れて下さい） このWBの図、A431細胞でのphospho STAT3の発現ではバンドの一番上は隣接する2レーンでも差があるように見えます。下に太っていってるというよりは、全体に膨らんでませんか？この場合は一番膨らんだところのサイドの部分で比較した方が差が無い（サイズの同じタンパクを比較している）ことになると思うのですがどうでしょうか？ もう一例 ttps://www.abcam.com/en-us/products/antibody-panels/pi3k-akt-signalling-pathway-panel-ab283852# こちらの二枚目のWBの図でも、バンドの上辺が同じ高さになってるようには見えないです。バンドの一番膨らんでる所のサイドでみても全部が同じ高さになるとは思いませんが、上辺でみるよりは差が少なくなりませんか？

(無題) 削除/引用 No.12653-18 - 2024/10/31 (木) 11:17:29 - マーカー >asanさん >厳密にやるならTOF-MSとかでペプチドレベルで精密質量のシフトで議論が必要でしょう。 私にこれらの知識が足りないのですが、やはり厳密にやるならそうなんですね。ただ、ここまでの厳密性を求められてはおらず、そこまでお金をかける気もないと思われるので、そこまで必要なら止めよう、となりそうです。 しかし後学の為に有用な情報です。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12653-17 - 2024/10/31 (木) 11:05:39 - おお >バンドの位置は、サイドが一番膨らんだところでやってみました。 まちがってます。 基本的にバンドの一番上のところまでの距離を図ります。というのは同じゲルで精製した蛋白を量を振って流すと、量が多くなるにつれて下に太ってきます。 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/srp6312 こちらの電気泳動のイメージがわかりやすいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12653-16 - 2024/10/31 (木) 11:03:20 - asan その目的なら、PNGaseFなどをin vitro処理などした上でバンドシフトを比較検討するとかそのような形で見るしかないと思います。 その糖鎖修飾に必要な酵素があるならノックアウト細胞株と比較するとか、少なくとも何かしらの条件付けをしたサンプル間でのバンドシフトを比較して、該当する抗体で推定される分子量付近にでるものの変化を議論するってのが古典的になやり方だと思います。 厳密にやるならTOF-MSとかでペプチドレベルで精密質量のシフトで議論が必要でしょう。

(無題) 削除/引用 No.12653-15 - 2024/10/31 (木) 10:31:14 - マーカー 皆様、レスをありがとうございます。 >なぜ分子サイズを正確に計算したいのか 「正確」に関して。申し訳ありません。私の書き方が悪かったです。そこまで正確に計測したい訳ではなかったのです。本文に「実際には95kDaかもしれないし、85kDa程度かもしれません」とかいたような場合で、おおよそのサイズは95kDaなのか90kDaなのか85kDaなのかを知りたかっただけなのです。 知りたかった理由について。、N'-Glycosylationが一つのアミノ酸（N)に起こった場合に、平均2-3kDaのサイズ増になると聞いたので、 1) ウェスタンブロットでの見かけ上（という表現でよいでしょうか？）のサイズからDeglycosylation後のサイズ75kDaを引いて 2) N'-Glycosylationのconsensus target sequence(N-X-S/T)の数で割った時に、実際に2-3kDaになるかどうか？ を知りたかったという、恐らく糖鎖修飾を専門にやってる方（じゃなくても、か）からするとそれ意味あるの？と言われそうな理由からです（あと、うさんのコメ、当たってます。ただ、参考にしてる文献がWBでサイズを論じているから、それに倣って指示を出しているので仕方が無い面もあります）。 この場合、前後で10kDaの差があると更に無意味が過ぎるようになるので、ある程度正確に知りたいという風に書きました。 あさん、おおさんが紹介して下さった方法を試してみました。やはりというか、精度が低くてちょっとうまくいきませんでした。qqさん、3さん指摘にありますが、私が使っているのがカラー付きのマーカーなのも原因かもしれません。バンドの位置は、サイドが一番膨らんだところでやってみました。 そもそも、consensus target sequenceであっても必ずN-Glycosylationが起こる訳では無いと論文にもあるし、平均2−3kDaといっても5kDaになることがあればそれで計算したらご破算だし、やはりこのような実験は無意味ですね。なぜに無意味なのか、を上手く伝えられるように考えます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12653-14 - 2024/10/30 (水) 12:51:58 - う 教授とか先輩から、正しい分子量を測って、って意味もなく単に言われているだけのように思う。

(無題) 削除/引用 No.12653-13 - 2024/10/30 (水) 07:14:27 - おお 正確な分子量を求めるなら電気泳動の移動度では難しいと思いますし、糖鎖修飾は尚更という意見もそうだろうなと思います。それとこれも指摘があるように糖鎖修飾自体一つのバンドと思っても糖鎖の削れ方が若干違ったりするとかあると思いますし意外とヘテロだったりすると思いますのでMSを使ってできたとしても一つに定まらないでしょう。 ただし、電気泳動上の移動度からの予測という観点で数値を与えたいなら前に示したように移動度と分子量でプロットすれば数字はでます。それをもとに85.5kDa speciesとか（言うなればA、B、Cとか名前をつける）いう表示を考えているのならそれは構いません。あくまでも電気泳動上での予測に基づいた数字です。

(無題) 削除/引用 No.12653-12 - 2024/10/29 (火) 21:43:30 - G25 ちょっと論点がずれてる発言があるようですが、 SDS-PAGEによるタンパク質の分子量のestimationの限界の話ではなくて(それは当たり前の話として)、 糖鎖のついたタンパク質の分子量のestimation ができるかどうかのでしょう。 SDS-PAGEでタンパク質の分子量が求められるという原理は、糖鎖の分子量には適用できません。

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