ウェスタンブロットで、検出したバンドのサイズがマーカーのサイズとは違う場合に、バンドのサイズを出来る限り正確に知る為にはどのような方法があるでしょうか？
私が研究しているタンパクは計算上のサイズは75kDaなのですが、N'-Glycosylationの為、ウェスタンブロットを行うと90kDa程度にバンドが見られます。Deglycosylationを行うとバンドが75kDaのところにシフトするので間違いないと考えられます。
さて、上で90kDa程度と書きましたが、これはかなり不正確だと思われます。私が使っているマーカー(バイオラドのPrecision Rainbow Marker)は100kDaと75kDaのバンドが出るので、この二つのマーカーバンドの間、真ん中より少し上にタンパクのバンドが出るので、まあ90kDa程度だろうと見積もっています。実際には95kDaかもしれないし、85kDa程度かもしれません。
このような場合、自分の研究しているタンパクのサイズの計測はどのように行うのがベストでしょうか？
intact massを行えば？という話は出たのですが、必要なタンパクの量が多すぎてちょっと準備出来そうにないので却下となりました。ウェスタンブロットの図から予測出来ればと思っています。
もしかしたら「マーカーレーンの各サイズのバンドの位置をプロットして直線を引いて、着目しているタンパクのバンドの位置と、ゲルの濃度（グラジェントを使ってます）をパラメーターとして入れると、タンパクサイズを予測してくれる」ようなソフトウェアなんかがないかと思って探してみたのですが、見つかりませんでした。
このような場合に皆様はどのようにされているか、教えて頂けると有り難いです。よろしくお願いいたします。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加