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(無題) 削除/引用 No.12653-51 - 2024/11/13 (水) 13:17:06 - う 前にも書きましたが想像は結構ですので、スキャンしてチャートと比較してください。

(無題) 削除/引用 No.12653-50 - 2024/11/13 (水) 10:09:51 - 774R ある程度の量までは位置を変えず太くなるだけなのでしょう。WBなら光量が上がるとバンドは太くなる。同じバンドでも露光時間を伸ばすと太りますから。 トンデモなくタンパク量が増えるとバンド自体が太る。そしてそれはバンドの下側が膨らむ形状になる。 ここでの意見の不一致はどっちの現象を見てるかの違いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12653-49 - 2024/11/13 (水) 10:01:57 - マーカー >おおさん >でこちらにどこでバンドの移動度をとるか解説がありますが、上で揃っていると見えるときは上、バンドの形状がそうでないものは太ったところとすると解説があります。 /www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/rf.html 一瞬なんとなく科学的ではないような気もしましたが、実際にバンドの形状が違うブロットがある訳なので（で、ちゃんとその理由（疎水性）もありますね）、それに応じて計測位置を変えるというのは解決方法の一つなのかもしれませんね。 >たとえば３つ目のリンクで上で揃っているようなバンドの形状のイメージですが、各レーンの蛋白が一緒のものであればそんなにきっちり揃っているようにも見えません。 仰る通り、私には揃っているように見えません。これはむしろピーク（サイドの一番太いところ）の方が揃うように見えます。こういうののほうが多いのでは、というのが私の印象でした。 ただ、（サンプルの説明が無いから実際に段階希釈したサンプルかどうかは100%の確度では言えませんが）No.12653-41で774Rさんが挙げて下さった最初のリンクは、中央の3レーンは（拡大してチェックしても）バンドの上部で揃ってます。 結局のところは、バンドが膨らむようであれば、希釈して流し直して計測する方がよっぽど正確だろうと思います。これは多分ここを読んで下さった方全員のコンセンサスが取れると思います。マーカーも色素無しのものの方が良さげですね。膨らみが小さいから。 皆様ありがとうございました。どのみち正確性は期するべくもない実験ですが、それでもその中でのベストの方法といえるものがわかったように思います。、

(無題) 削除/引用 No.12653-48 - 2024/11/13 (水) 02:59:59 - おお >[Re:47] うさんは書きました : > ちなみに、目視で上に線を引くって意味あるんですかね。 > ベースラインと頂点の高さが判断材料になると思うんですが、何を基準に線を引いているんでしょうか。 たぶんピークとほぼ同等なんだと思います。イメージではかまぼこを逆さまにしたような形になっていますので、上から見ていってバンドが現れたところで鋭く立ち上がってピークになり若干尾を引いた感じで下がっていくといったchromatogramが想像できますので（もちろん濃淡もありますので絶対的かはわかりませんけど）。もちろん指摘があるようにオーバーロードだとバンドは歪になってきますし、量的にほぼ直線のバンドとみなせるときはあまり関係がない話だと思います。 理論的な話とかもうちょっと探ってみたい気がしますが、今とのこと探しきれてないですね。

(無題) 削除/引用 No.12653-47 - 2024/11/12 (火) 12:55:29 - う ちなみに、目視で上に線を引くって意味あるんですかね。 ベースラインと頂点の高さが判断材料になると思うんですが、何を基準に線を引いているんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12653-46 - 2024/11/12 (火) 01:59:14 - おお あ、もう一つ見つけていたので貼っておきます。 https://www.researchgate.net/figure/Affinity-purification-results-of-the-recombinant-proteins-separated-by-passage-through-a_fig3_365156739

(無題) 削除/引用 No.12653-45 - 2024/11/12 (火) 01:55:11 - おお 上出揃っているという典型例はたとえば www.ptglab.com/applications/affinity-purification/ こちらもそんな感じですがWBもしてまして、バンドの形状が比較できます。 plos.figshare.com/articles/figure/_Protein_expression_and_purification_of_recombinant_his_tagged_ALDH3A1_/638245?file=968767 でこちらにどこでバンドの移動度をとるか解説がありますが、上で揃っていると見えるときは上、バンドの形状がそうでないものは太ったところとすると解説があります。 /www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/rf.html でバンドの形については以下に解説があります。 www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/gellab3.html ２番目の図ですが、疎水性が強い場合は上下ほぼ対称になると書いています。 私は移動度が必要なことがそんなに必要ではないので、上で揃って下に太って行くんだなという典型的なものの解説しか頭になかったですが、プラクティカルに測ろうとするとそう典型的ではないことも多いような印象がグーグルの検索でのバンドのイメージから見て取れました。 たとえば３つ目のリンクで上で揃っているようなバンドの形状のイメージですが、各レーンの蛋白が一緒のものであればそんなにきっちり揃っているようにも見えません。 でそういういろいろな情報を下に思うのですが、移動度を比較したい場合はバンドの形状にも注目すべきだけど、タンパク量（シグナルの強さ）も揃えておかないとまあまあブレるんだなと思った次第です。 でお示しのものもそういうことなのかもしれません。角度についてはっきりさせるには両側にマーカーとか同じものがほしいですね。

(無題) 削除/引用 No.12653-44 - 2024/11/09 (土) 13:51:57 - マーカー >774Rさん >私の予想では、WBの感度で「大量」と感じる程度では、下にバンドが膨らむことはあまりない。 CBB染色で「大量」と感じるほど流すと、下に膨らみ上で揃うという感覚になるのだと思う。 レスありがとうございます。ネットで見た染色の図の傾向から、私もそういう印象を持ちました。 >ぽいうさん、おおさん 阪大のリンクの図をダウンロードして、直線を引いてみました。 https://ibb.co/WF4jN2q （かなり）拡大してみて頂けますか？傾きを修正した場合、ピークで取る方が良さげ（より多くのバンドで同じ高さで計測できる）に見えないですか？ 「上で揃ってる」という前提を持たずに見れば、傾いてると判断するのが普通だと思うのですが、どうでしょうか？ネットに上がってる図は必ずまっすぐであると保証された訳でもないので、見てる方で補正するのは別におかしなことでは無いと思います。-1度でやりましたが、人によっては-2度にすると思います。各レーンのバンドの上辺、下辺が左右で出来る限り水平に近くなるように傾けたつもりです（バンドそのものが歪んでいて出来ていないところもあります。最大公約数を取る、的にやったつもりです）。 自分の主張に合わせて恣意的に傾けたつもりは無いのですが、私にバイアスがかかっている可能性は否定しません。 >おおさん >実際のイメージ(データ)を使って説明してましたけどね。 お示しのリンクの図でも同じような直線を引く作業をやったのですが、確か、マーカーの左側だとピークで取る方が明確に良さげで、マーカーの右側では上で取っても良かった（ピークでとっても良い）ような記憶が。もう1週間も前のことでファイルを消してしまった。おおさんも似たようなことやってませんかね？

(無題) 削除/引用 No.12653-43 - 2024/11/09 (土) 00:50:56 - おお >[Re:40] マーカーさんは書きました : > >おおさん > > お付き合い頂きありがとうございます。文書を探して頂けるとのこと有り難いです。 > > ただ、文章にどう書いてあったかよりも、データを見て自分自身の頭でどう考えるかの方が私にとっては大事です。 実際のイメージ(データ)を使って説明してましたけどね。

(無題) 削除/引用 No.12653-42 - 2024/11/08 (金) 13:40:59 - ぽいう 阪大のリンクは上で揃ってるでしょ。このゲルをみて上で揃っていると判断しないのは、電気泳動をあまりやったことのない人。

(無題) 削除/引用 No.12653-41 - 2024/11/08 (金) 10:11:12 - 774R 精製タンパクを流してゲルをCBB染色すると以下のようになることが多い。 http://www.bio-craft.co.jp/products/stain/ http://www.protein.osaka-u.ac.jp/metabolism/sample.html この長いスレの議論、私の予想では、WBの感度で「大量」と感じる程度では、下にバンドが膨らむことはあまりない。 CBB染色で「大量」と感じるほど流すと、下に膨らみ上で揃うという感覚になるのだと思う。

(無題) 削除/引用 No.12653-40 - 2024/11/08 (金) 08:45:41 - マーカー >おおさん お付き合い頂きありがとうございます。文書を探して頂けるとのこと有り難いです。 ただ、文章にどう書いてあったかよりも、データを見て自分自身の頭でどう考えるかの方が私にとっては大事です。私が出したリンク先の ttp://www.protein.osaka-u.ac.jp/metabolism/sample.html の図、見て頂けました？上で揃ってますか？ 私自身のCBB染色の経験を考えても、ピークで取る方が正確（同じタンパクを違う量流したとしても、ピークは同じ高さでとれる。上部は必ずしも一直線に揃わない）だと思います。 繰り返しになりますが、 >CBBで染めたものの写真をソフトに取り込んでコントラストを変えた場合でもバンドは上下に広がりますよね？そして、量が多いものの方が広がり方が大きくなる。この点を考えると、CBBで染めた場合でも正確を期すならバンドのピークで測るべきであって、上部では無いのではないか？ が私の主張です。決定的に間違ってるぞ、とかあったら教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.12653-39 - 2024/11/08 (金) 07:58:50 - おお CBB染色などでバンドの上の部分までの距離を測ると言うのは何らかの文書（本か文献）で見たものです。どれを見たかについては相当前なので思い出せません。おそらく昔からあるSDSPAGEや蛋白精製に関連したほんだと思いますが探してみます。 よくカラムなどで蛋白精製をすると蛋白が数フラクションにまたがって蛋白が検出されるとき、SDSPAGEで上部が揃っていて下に膨らんでいるイメージがよく見られます。なので上記のインフォメーションが確認できたかなと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.12653-38 - 2024/11/08 (金) 01:28:06 - マーカー >memeさん はい。ケミルミを使っての話では納得して貰えてるはず、と思ってます。ただ、私は今は論を広げて「CBB染色でも上部じゃ無い、ケミルミと同じでピークだ」という主張をしてるので、ある意味私からおおさんへのチャレンジです。チャレンジという表現で良いのかな？もっとダイレクトにいえば、おおさんの「CBB染色なら上部で取る」に対して、今度は私の方から「まちがってます」と言ってる状態です。 >かかかさん >自分で、サンプルをシリアルダイリューションしてウエスタンブロットして試せばいいじゃない。 いや、ウェスタンの話は既に終わってます。上部では無くピークの位置で取る、が解です。これはおおさんも納得されてるはず。

(無題) 削除/引用 No.12653-37 - 2024/11/07 (木) 16:41:08 - かかか 自分で、サンプルをシリアルダイリューションしてウエスタンブロットして試せばいいじゃない。 推測に推測で答えても結論出ないでしょ。それが実験科学のキホン

(無題) 削除/引用 No.12653-36 - 2024/11/07 (木) 07:31:14 - meme わかりにくい書き方をされていますが、ご自身の間違いを認められたのだと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.12653-35 - 2024/11/07 (木) 05:50:22 - マーカー >おおさん トピ本題からは離れた話なので、うざったい時は無視して下さい。 >CBBで染める限りバンドの上部で見るべきだけど、化学発光でそれが成り立たない CBBで染めたものの写真をソフトに取り込んでコントラストを変えた場合でもバンドは上下に広がりますよね？そして、量が多いものの方が広がり方が大きくなる。この点を考えると、CBBで染めた場合でも正確を期すならバンドのピークで測るべきであって、上部では無いのではないか？と思います。 おおさんがリンクを貼った図、Reducedの方（マーカーの左側）を拡大してみると一番左のレーン（ロードした量が最小）が少し下がっています。試しにパワポに取り込んで直線を引いてみましたが、上部で取るよりピーク（サイドの一番膨らんだところ）で取った方がレーン間での差は（極々微小ではありますが）小さくなるように見えました。 上に書いた「量が多いものの方が広がり方が大きくなる」が間違っているなら、私の完全な間違いですが、 ttp://www.protein.osaka-u.ac.jp/metabolism/sample.html あたりを見ても、やはりピークで取る方が正確なのではないでしょうか？これも図をダウンロードして直線を引いてみましたが（その際、傾きを直しました）、上部で引くよりもピーク（サイドの一番膨らんだところ）で引く方が、全レーンで真っ直ぐ引けます。上部で引くと、傾きを色々直したりしても全レーンに対して直線は引けませんでした。

(無題) 削除/引用 No.12653-34 - 2024/11/07 (木) 04:19:39 - おお 議論の結果化学発光で見る限りピークで見ればいいというところに行きつきました。 CBBで染める限りバンドの上部で見るべきだけど、化学発光でそれが成り立たないというマーカーさんの指摘があったので、じゃあCBBで染めたときの上部の位置は化学発光でどうやって決めればいいのだろうと思ってました。露光時間を変えただけでバンドは上下に太ってきますし、CBBで検出されるイメージがどのように化学発光で反映されるのか、それがわからないなら量を振ったりしてどこを取るべきか検証するのがいいのかと思っていましたけど。 そもそも細胞のLysateに含まれる特定の蛋白はたいてい多くてngオーダーですから単品で流してもそんなに幅のある泳動パターンにはならないのでCBBで見られるような下に太っていくバンドよりはほぼ１本の線だろうと気づきました。また目的のバンドの蛋白量が多いならば薄めればいいという指摘もしていただきました。ほぼ一線のバンドならそこから上下に太ったとしてもバンドの位置はそのピークと考えてもいいだろうと言う結論が私の中で出た次第です。 感覚でピークを見たらいいというのは私にとってはちょっと怖いので色々と追求した次第です。 いろいろな角度の話がいろいろな人から出てたのでわかりにくかったのかもしれませんのでまとめておきます。

(無題) 削除/引用 No.12653-33 - 2024/11/07 (木) 03:04:24 - マーカー まあ、もう終わったような話で書き込むのもなんなんですが。 >オーバーロードでバンドがぼってりになったら、アプライ量を減らしてもう一度やり直し が正しいと私も思います。 とはいえ、やり直した場合のバンドの位置って、ぼってりになった場合のバンドの上部ですか？それともピークの最も高いところですか？どう考えても上部にはならんと思うのだが……。

(無題) 削除/引用 No.12653-32 - 2024/11/06 (水) 02:02:27 - おお >[Re:31] うさんは書きました : > 最初の質問の趣旨が、ゲル上のサイズをなるべく正確に測りたいということなので、オーバーロードでバンドがぼってりになった時にどこを測るかというよりは、バンドが細くなるように流して計った方が良いと思うのです。 > > オーバーロードでバンドがぼってりになったら、アプライ量を減らしてもう一度やり直しましょう、というのが私の意見ですが、バンド（クロマトグラム）は台形になっているようと思います。私はサイズを測るのが目的ならこの出るでは計りません。絡むつもりはないです、念のため。 > > > ありがとうございました。確かに移動度を測るにはオーバーロードと言う指摘はそうかも知れません。 普通細胞からのLysateだとバンド的にはそこまで量がないものがほとんどである事に気付くべきでした。ならばHRPで検出するなら露光時間を調整してシャープなバンドのところで測ればいいか、ピークに合わせれば大丈夫ですね（均一な分子であることが大前提で）。もちろん量を減らすことも泳動パターンをきれいにするのに寄与するのでいいかもしれません。きれいに流すと尖った鉛筆で線を引いたような感じにもなったりします（X-ray フィルムのときの経験ですけど）。 お付き合いありがとうございました。

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