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(無題) 削除/引用 No.12653-21 - 2024/10/31 (木) 17:14:48 - う スキャンした輝度のピーク位置じゃないですかね。SDS -PAGEはゲル濾過のようなものですし。 上で測るか、下で測るかは写真やゲルを直接定規で測るときのことだと思いますけど、ImageJとかでスキャンすればチャートになるので、そのピーク位置を測れば良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.12653-20 - 2024/10/31 (木) 13:19:59 - おお あ、そうか。発光を見ているのでシグナルが強くなるとバンドの位置より外にシグナルが広がるのか。なら正確なサイズって測れる？

(無題) 削除/引用 No.12653-19 - 2024/10/31 (木) 11:47:24 - マーカー >おおさん >基本的にバンドの一番上のところまでの距離を図ります。 これ、本当にそうなんでしょうか？示されたリンクの図では確かにそうですが、なんか、こんな上辺が切り取られたみたいな形のバンドは珍しい部類じゃないでしょうか？ 実際に私が普段行っているウェスタンブロットでは、シグナルの強さが2倍とか3倍になる場合でも、「量が多くなるにつれて下に太って」いってるようには見えないです。 ttps://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/phospho-stat3-tyr705-d3a7-xp-rabbit-mab/9145 （すいません。何故か直リンクを拒否されたので、hをつけてコピペしてアドレスバーに入れて下さい） このWBの図、A431細胞でのphospho STAT3の発現ではバンドの一番上は隣接する2レーンでも差があるように見えます。下に太っていってるというよりは、全体に膨らんでませんか？この場合は一番膨らんだところのサイドの部分で比較した方が差が無い（サイズの同じタンパクを比較している）ことになると思うのですがどうでしょうか？ もう一例 ttps://www.abcam.com/en-us/products/antibody-panels/pi3k-akt-signalling-pathway-panel-ab283852# こちらの二枚目のWBの図でも、バンドの上辺が同じ高さになってるようには見えないです。バンドの一番膨らんでる所のサイドでみても全部が同じ高さになるとは思いませんが、上辺でみるよりは差が少なくなりませんか？

(無題) 削除/引用 No.12653-18 - 2024/10/31 (木) 11:17:29 - マーカー >asanさん >厳密にやるならTOF-MSとかでペプチドレベルで精密質量のシフトで議論が必要でしょう。 私にこれらの知識が足りないのですが、やはり厳密にやるならそうなんですね。ただ、ここまでの厳密性を求められてはおらず、そこまでお金をかける気もないと思われるので、そこまで必要なら止めよう、となりそうです。 しかし後学の為に有用な情報です。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12653-17 - 2024/10/31 (木) 11:05:39 - おお >バンドの位置は、サイドが一番膨らんだところでやってみました。 まちがってます。 基本的にバンドの一番上のところまでの距離を図ります。というのは同じゲルで精製した蛋白を量を振って流すと、量が多くなるにつれて下に太ってきます。 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/srp6312 こちらの電気泳動のイメージがわかりやすいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12653-16 - 2024/10/31 (木) 11:03:20 - asan その目的なら、PNGaseFなどをin vitro処理などした上でバンドシフトを比較検討するとかそのような形で見るしかないと思います。 その糖鎖修飾に必要な酵素があるならノックアウト細胞株と比較するとか、少なくとも何かしらの条件付けをしたサンプル間でのバンドシフトを比較して、該当する抗体で推定される分子量付近にでるものの変化を議論するってのが古典的になやり方だと思います。 厳密にやるならTOF-MSとかでペプチドレベルで精密質量のシフトで議論が必要でしょう。

(無題) 削除/引用 No.12653-15 - 2024/10/31 (木) 10:31:14 - マーカー 皆様、レスをありがとうございます。 >なぜ分子サイズを正確に計算したいのか 「正確」に関して。申し訳ありません。私の書き方が悪かったです。そこまで正確に計測したい訳ではなかったのです。本文に「実際には95kDaかもしれないし、85kDa程度かもしれません」とかいたような場合で、おおよそのサイズは95kDaなのか90kDaなのか85kDaなのかを知りたかっただけなのです。 知りたかった理由について。、N'-Glycosylationが一つのアミノ酸（N)に起こった場合に、平均2-3kDaのサイズ増になると聞いたので、 1) ウェスタンブロットでの見かけ上（という表現でよいでしょうか？）のサイズからDeglycosylation後のサイズ75kDaを引いて 2) N'-Glycosylationのconsensus target sequence(N-X-S/T)の数で割った時に、実際に2-3kDaになるかどうか？ を知りたかったという、恐らく糖鎖修飾を専門にやってる方（じゃなくても、か）からするとそれ意味あるの？と言われそうな理由からです（あと、うさんのコメ、当たってます。ただ、参考にしてる文献がWBでサイズを論じているから、それに倣って指示を出しているので仕方が無い面もあります）。 この場合、前後で10kDaの差があると更に無意味が過ぎるようになるので、ある程度正確に知りたいという風に書きました。 あさん、おおさんが紹介して下さった方法を試してみました。やはりというか、精度が低くてちょっとうまくいきませんでした。qqさん、3さん指摘にありますが、私が使っているのがカラー付きのマーカーなのも原因かもしれません。バンドの位置は、サイドが一番膨らんだところでやってみました。 そもそも、consensus target sequenceであっても必ずN-Glycosylationが起こる訳では無いと論文にもあるし、平均2−3kDaといっても5kDaになることがあればそれで計算したらご破算だし、やはりこのような実験は無意味ですね。なぜに無意味なのか、を上手く伝えられるように考えます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12653-14 - 2024/10/30 (水) 12:51:58 - う 教授とか先輩から、正しい分子量を測って、って意味もなく単に言われているだけのように思う。

(無題) 削除/引用 No.12653-13 - 2024/10/30 (水) 07:14:27 - おお 正確な分子量を求めるなら電気泳動の移動度では難しいと思いますし、糖鎖修飾は尚更という意見もそうだろうなと思います。それとこれも指摘があるように糖鎖修飾自体一つのバンドと思っても糖鎖の削れ方が若干違ったりするとかあると思いますし意外とヘテロだったりすると思いますのでMSを使ってできたとしても一つに定まらないでしょう。 ただし、電気泳動上の移動度からの予測という観点で数値を与えたいなら前に示したように移動度と分子量でプロットすれば数字はでます。それをもとに85.5kDa speciesとか（言うなればA、B、Cとか名前をつける）いう表示を考えているのならそれは構いません。あくまでも電気泳動上での予測に基づいた数字です。

(無題) 削除/引用 No.12653-12 - 2024/10/29 (火) 21:43:30 - G25 ちょっと論点がずれてる発言があるようですが、 SDS-PAGEによるタンパク質の分子量のestimationの限界の話ではなくて(それは当たり前の話として)、 糖鎖のついたタンパク質の分子量のestimation ができるかどうかのでしょう。 SDS-PAGEでタンパク質の分子量が求められるという原理は、糖鎖の分子量には適用できません。

(無題) 削除/引用 No.12653-11 - 2024/10/29 (火) 20:51:12 - 3 そこまで正確な分子量にこだわる理由はなんでしょうか。SDS-PAGEは極めて簡便に比較的理論値に合う分子量が示されることが多い方法として汎用されているのであって、あくまで見かけの分子量であり、もともと厳密にわずかな分子量の変化を捉えて定量的に議論するような実験法ではありませんし、もしそこまで必要ならば別の方法で、ということになります。SDS-PAGEの示す分子量は、まあだいたいそのくらいで理論値からそれほど外れていない、という感じで、アミノ酸組成などによってはSDS-PAGEの示す分子量が理論値と大きく異なることもあります。 なので方法上の限界を考えるとSDS-PAGEで85KDaか95KDaかを悩むこと自体どんなものかなあと思いました。 有色分子量マーカーもたとえば75KDaのマーカーもメーカーによって異動度は異なることはしばしばあるし、正確な分子量推定は無理と説明に書いてあることもあります。（分子量をある程度厳密に推定したいなら未着色マーカーの方が良い） 正確な分子量測定については昔はTOF-MASSとか使って調べる方法もありましたが、分子量の小さいタンパク質向きで、大きいのは難しいように思います。

(無題) 削除/引用 No.12653-10 - 2024/10/29 (火) 19:56:25 - TS 他の方のご意見がごもっともと思うのですが、 もし可能でしたら、なぜ分子サイズを正確に計算したいのかをお示しすることは可能でしょうか。 ゲルの移動度では限界があると私も思いますが、目的によっては他に適したアプローチがないのかなと思いました。 抗体の特性性を確認するためではないですよね？

(無題) 削除/引用 No.12653-9 - 2024/10/29 (火) 19:54:28 - qq ＞もしかしたら、、、、見つかりませんでした。 期待するようなソフトの機能は、ImageJで実行できるでしょう。（analyse>curve-fittingの辺りです）詳細は、ネットで説明するのも面倒なので、ご自分で努力するか、誰かを探してください。 全てのバンドは幅があるけれどどこを指定するつもりでしょうか？ Precision Standardは、色素のついていないマーカーもあると思います。 マーカーの分子サイズは、基本的にはnon-colorのマーカーのサイズだと思いますが、実用的にcolorマーカーも同じ値で使われていると思います。 更に、カラーマーカーは幾分バンドが太くなってしまいます（precision Standardはそこそこシャープだと思いますが、、）。 そんなわけで、どうやっても正確な分子量が得られるわけではないのです。 それでも、一定の誤差範囲に再現的に値を得ることができるかもしれませんから、努力しても悪くはないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12653-8 - 2024/10/29 (火) 19:03:12 - おお https://www.labxchange.org/library/items/lb:LabXchange:02a2a79b:html:1 II. Estimating molecular weight 移動度から分子量を計算する方法はありますが、その数字が持つ意味という点では指摘されている通りです｡それでも数字を当てたいと思うなら、計算すればいいでしょう｡それは何を言わんとするかなどによると思います｡

(無題) 削除/引用 No.12653-7 - 2024/10/29 (火) 17:36:39 - う 糖鎖込みで正確な分子量が必要な理由を知りたい。糖鎖ってヘテロだし。

(無題) 削除/引用 No.12653-6 - 2024/10/29 (火) 17:27:27 - G25 糖鎖にはSDSが抱合しない、あるい抱合してもタンパク質とは割合が違う、 糖鎖はペプチド鎖に対して側鎖。枝分れ構造なので単純な線形ではない。 ペプチドだけなら鎖長と分子量がほぼ比例とみなせるが、 ペプチドと糖鎖じゃパラメータは違うだろう。 また、糖鎖の長さや分岐などは多様雑多で、一義的には決まらなかもしれない。 ということで、WBでやるのは難題だと思います。 やはり、当該タンパク質を単離精製して糖鎖分析するしか、、、、

(無題) 削除/引用 No.12653-4 - 2024/10/29 (火) 16:45:14 - 独り言 たぶん、泳動だけから正確な分子量を測定することを難しいと思う。 例えば75kDaのマーカーと一緒に、75kDaの目的タンパク質を泳動しても、75kDaと異なる位置に出たりもします。 なぜなら、マーカーの位置が100％は正しくない可能性があります。 マーカーには色素がついているため、その分、分子量が少し増えるし、マーカーも何らかのタンパク質を用いているはずですが、その＋またはーのチャージの数によって、同じ分子量でも異なるアミノ酸配列であれば移動度は異なる場合があります。 そもそも、なぜ正確な分子量が知りたいのでしょうか？ 勝手な想像ですが、例えば、目的タンパク質の一部アミノ酸配列が欠損とかを予想しているのであれば、目的タンパク質をプラスミドなどから外来的に発現させて、全く同じ位置に検出されるを調べれば、ある程度わかります。

(無題) 削除/引用 No.12653-3 - 2024/10/29 (火) 16:43:48 - あ ゲル→メンブレン

(無題) 削除/引用 No.12653-2 - 2024/10/29 (火) 16:42:40 - あ ゲルを写真に撮ったのち、ウエルからマーカーのバンドまでの距離を測って（ピクセルでもcmでもいいので）、片対数グラフにプロットすれば、分子サイズを計算できます。古典的な方法です。 ImageJ/Fujiなどのソフトウエア上で、スキャンしたゲルの写真を使ってできます。 精度は高くないのと、あくまでSDS-PAGE上の分子サイズです。

WBでマーカーからのサイズの予想を出来る限り正確に行いたい 削除/引用 No.12653-1 - 2024/10/29 (火) 16:09:30 - マーカー ウェスタンブロットで、検出したバンドのサイズがマーカーのサイズとは違う場合に、バンドのサイズを出来る限り正確に知る為にはどのような方法があるでしょうか？ 私が研究しているタンパクは計算上のサイズは75kDaなのですが、N'-Glycosylationの為、ウェスタンブロットを行うと90kDa程度にバンドが見られます。Deglycosylationを行うとバンドが75kDaのところにシフトするので間違いないと考えられます。 さて、上で90kDa程度と書きましたが、これはかなり不正確だと思われます。私が使っているマーカー(バイオラドのPrecision Rainbow Marker)は100kDaと75kDaのバンドが出るので、この二つのマーカーバンドの間、真ん中より少し上にタンパクのバンドが出るので、まあ90kDa程度だろうと見積もっています。実際には95kDaかもしれないし、85kDa程度かもしれません。 このような場合、自分の研究しているタンパクのサイズの計測はどのように行うのがベストでしょうか？ intact massを行えば？という話は出たのですが、必要なタンパクの量が多すぎてちょっと準備出来そうにないので却下となりました。ウェスタンブロットの図から予測出来ればと思っています。 もしかしたら「マーカーレーンの各サイズのバンドの位置をプロットして直線を引いて、着目しているタンパクのバンドの位置と、ゲルの濃度（グラジェントを使ってます）をパラメーターとして入れると、タンパクサイズを予測してくれる」ようなソフトウェアなんかがないかと思って探してみたのですが、見つかりませんでした。 このような場合に皆様はどのようにされているか、教えて頂けると有り難いです。よろしくお願いいたします。

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