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(無題) 削除/引用 No.12650-12 - 2024/10/31 (木) 11:14:47 - asan 混ざり物のサンガーシーケンスを分解して出すソフトウエアはありますが、シーケンスの波形強度は単純な足し算ではなくて結構ばらつくのでせいぜい2種類ぐらいのまざりものの比率を推定するぐらいで、それ以上になってくると結構眉唾物だと思います。 で、実際には一番いいのはNGSでディープシーケンスをするのですが、簡単にできる環境でなければその領域をプラスミドにクローニングして、複数( 4-8つぐらい？）コロニーから抽出した配列を読むしかありません。 培養のがん細胞でKOクローンを取ると、多くの場合染色体異数性のためN>3以上のパターンが出ますが、ほとんどの場合で3-5ぐらいで7つ以上も混じるのはあまりないと思います。CRISPRのindelについてはマイクロホモロジーによって偏るケースもありますが、7つのいうのはおそらく混ざり物を無理やり評価したためでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12650-11 - 2024/10/30 (水) 06:55:10 - おお その遺伝子が蛋白をコードするものであれば、WBをして確認してみるのも手では？

(無題) 削除/引用 No.12650-10 - 2024/10/29 (火) 22:40:52 - G25 アンプリコンをPAGEで分離してもバリアントを見分けられるかも。1塩基長の差を見分けられますから。 良いサイズマーカーが思い浮かばないけど、 いっそurea変性PAGEで一本鎖で泳動して、シークエンスラダーをマーカー、目盛りにしようか

(無題) 削除/引用 No.12650-9 - 2024/10/29 (火) 13:04:40 - toto それはPCR産物をNGSしないとわからないですよ。ナノポアやってる人が近くにいなければ、外注でも安くできます。

(無題) 削除/引用 No.12650-8 - 2024/10/29 (火) 01:29:53 - おお ちなみにそのクローン以外も取ってゲノムの解析をしていると思いますが、それも７つほどありそうですか？

(無題) 削除/引用 No.12650-7 - 2024/10/28 (月) 16:40:53 - おお >[Re:6] ようさんは書きました : > 皆様ご回答ありがとうございます。 > ・-2,-4,-7,+8,+9+,+12,+16については、deletionとinsertionとなります。-2＝2塩基のdeletion。説明不足で大変失礼しました。 > > ・やはりシングルセルで播き直して再クローニングしてみたいと思います。 > > ・シーケンスをして複数の配列が重なったデーターから検出されたのでしょうか？ > ＞＞CRISPR ICEという解析ツールを使用しています。複数波形からindelパターンを読み取ってくれます。 そう言うのは存じ上げているのですがそんなに多くのパターンを認識できるものかとか、、、ちょと不思議な感じがしたのです。あるいは波形にノイズが重なっていてそうなってしまったとか。

(無題) 削除/引用 No.12650-6 - 2024/10/28 (月) 12:07:28 - よう 皆様ご回答ありがとうございます。 ・-2,-4,-7,+8,+9+,+12,+16については、deletionとinsertionとなります。-2＝2塩基のdeletion。説明不足で大変失礼しました。 ・やはりシングルセルで播き直して再クローニングしてみたいと思います。 ・シーケンスをして複数の配列が重なったデーターから検出されたのでしょうか？ ＞＞CRISPR ICEという解析ツールを使用しています。複数波形からindelパターンを読み取ってくれます。ただあくまで参考程度で見ているので、今後TAクローニングも予定しています。

(無題) 削除/引用 No.12650-5 - 2024/10/27 (日) 19:52:04 - おお インデルで9とか12はOKなのですか？どういうデザインになってるかわからないので、、、 それと7つほどインデルパターンが一つのクローンから検出されたようですが、シーケンスをして複数の配列が重なったデーターから検出されたのでしょうか？だとしたらそこまで沢山の配列が検出できるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12650-4 - 2024/10/27 (日) 18:40:48 - G25 > -2,-4,-7,+8,+9+,+12,+16など複数パターン検出されています。 jargonがわからないのだけれど、分野外にもわかるように平たくいうとどういうことですか？ ああ、indelのヌクレオチド数ですか。 実はsingle clone 単離を失敗しているという可能性は完全に排除できる？ あるいは単離してから新たに生じたcleavage、indelの可能性は。単離した時点ではノックアウトはヘテロで、インタクトだったアリルが増殖途中で独立してノックアウトされたとか。だとしたら再クローニングで解決しそうですけど。 細胞株の核型は？ 倍数性はどういうやつ？ 標的遺伝子が、がん細胞でよくあるように、遺伝子増幅したりしてないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12650-3 - 2024/10/27 (日) 12:19:59 - Mont 不死化した培養細胞の場合は、2コピー以上のアレルがあるのは割と普通なので、複数パターン出るのも普通です。ただ実際に何コピーあるかは、わからないことが多いです。独立したシングルクローンを幾つか調べれば、アレルの数は予想できると思います。またシングルクローンなのかどうかも予想できるでしょうが、数をこなさないと見えてこないので結構大変です。以前、同じような状況で、TAクローニングで確認したことがあります。

(無題) 削除/引用 No.12650-2 - 2024/10/27 (日) 11:57:31 - s 遺伝子Xノックアウトパターンが-2,-4,-7,+8,+9+,+12,+16など複数パターン検出されています。 とはどういうことでしょうか？

ノックアウト後のヘテロパターン 削除/引用 No.12650-1 - 2024/10/27 (日) 00:30:02 - よう CRISPRである遺伝子Xをノックアウトした後、シングルセルで培養したにもかかわらず、そのシングルセルを増やした後の遺伝子Xノックアウトパターンが-2,-4,-7,+8,+9+,+12,+16など複数パターン検出されています。 元々遺伝子Xが2コピー以上の場合はこのような結果になることも多いのでしょうか？ 単に2コピー以上のアレルがあり、異なるindelが導入されたヘテロと考えてよいのか（→TAクローニングで確認でしょうか？） あるいは細胞自体がヘテロな集塊になっているのか、、後者の可能性もあるのであれば、再度シングルセルにする予定です。

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