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細胞の剥離方法 トピック削除
No.1265-TOPIC - 2012/12/19 (水) 02:13:15 - もん
トリプシンを用いずに接着細胞を剥離する方法についてご教授ください。

２種の細胞種（細胞Aと細胞B）が混在する培養細胞から、細胞AのマーカータンパクのMACSビーズを使って細胞Aを除去することにより、高純度の培養細胞Bを得ようとしています。

MACSビーズのデータシートには、細胞の剥離にトリプシンを使うとエピトープ（CD抗原）が変性するのでトリプシンは使うべきではないと書かれています。
そこで、EDTAやセルスクレーパーでの剥離を試みてみましたが、剥離した細胞にかなりのダメージがあり、その後の培養に使うのは難しい状態でした。
また、強引にトリプシンで剥離してみましたが、データシートに書かれている通り、今後はMACSビーズによる細胞Aの除去率が極端に下がってしまいました。

トリプシン以外でダメージが少なく接着細胞を剥離する何かよい方法があればお教えください。
あるいはEDTAを上手く使えば、細胞にダメージなく剥離できるものなのでしょうか？

よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.1265-8 - 2012/12/20 (木) 10:13:00 - akira
accutaseを使用するという手もあります。

CD系の表面抗原を利用したcell-isolationで使用しましたが、きれいに分離できていました。

(無題) 削除/引用
No.1265-7 - 2012/12/20 (木) 03:02:08 - もん
いろいろご意見ありがとうございます。
TripLE selectは手元にあったのですが、Trypsinと同様マーカーがダメージを受けるような気がして使っていませんでした。細胞マーカーのダメージが少ないようなら一度使ってみようと思います。
あとは、非酵素性の細胞剥離液を購入してそちらも検討してみます。

TripLE select 削除/引用
No.1265-6 - 2012/12/19 (水) 14:34:07 - DrCarter
TripLE selectは、tripsinと同等の効果かつ細胞毒性がほとんどないのでよいのではないでしょうか。
出典は明らかではありませんが、細胞マーカーの障害も非常に少ないと教わり、FACS前の細胞処理に使用していました。

(無題) 削除/引用
No.1265-5 - 2012/12/19 (水) 11:18:47 - TS
原理はEDAT, Citrateなどでしょうが、
市販のNon-enzymatic dissociation solutionのようなものがあります。

他の用途で使用したことはありますが、作用が穏やかである代わりに
細胞毒性は少ない気がします。

C5789 Sigma
細胞剥離液, 非酵素性 1×
Cell Dissociation Solution Non-enzymatic 1x

(無題) 削除/引用
No.1265-4 - 2012/12/19 (水) 10:54:26 - KY
ノコダゾールやコルヒチンなどでＭ期に停止させれば、細胞が丸くなってはがれます。実際に細胞同調実験などではこれらの薬剤を処理してFACSしている論文はやまほどあるはずです。
用いている細胞がこれらの薬剤を長時間（１２時間とか）しても死なない細胞であれば、細胞のセルソーター分離もできるかとは思います。

(無題) 削除/引用
No.1265-3 - 2012/12/19 (水) 10:26:09 - ~
ダメージは細胞によるでしょうから何とも言えませんが、
池田理化のメビオールゲルのように、冷やすとゾル状になる基質の上で培養してはいかがでしょうか。

細胞の剥離方法 削除/引用
No.1265-2 - 2012/12/19 (水) 07:43:18 - 私も悩んでます
同じ悩みを持つ研究者で、ご参考になればいいのですが、、、

10mMEDTA、37度、5分でセルスクレーパーではがして、細胞生存率40％、5mMEDTAであとは同じで、60％〜75％、5mMEDTAで5分、37度の後、そのままトリプシンを最終濃度が通常の1/5になるように加えて1分くらい置いてからセルスクレーパーではがして、10％でした。

私の場合ははがした後、FACSで細胞表面抗原を見るだけで、確かにトリプシンだとデータは落ちますが、EDTAによる死細胞の増加も無視できませんでした。

細胞の剥離方法 削除/引用
No.1265-1 - 2012/12/19 (水) 02:13:15 - もん
トリプシンを用いずに接着細胞を剥離する方法についてご教授ください。

２種の細胞種（細胞Aと細胞B）が混在する培養細胞から、細胞AのマーカータンパクのMACSビーズを使って細胞Aを除去することにより、高純度の培養細胞Bを得ようとしています。

MACSビーズのデータシートには、細胞の剥離にトリプシンを使うとエピトープ（CD抗原）が変性するのでトリプシンは使うべきではないと書かれています。
そこで、EDTAやセルスクレーパーでの剥離を試みてみましたが、剥離した細胞にかなりのダメージがあり、その後の培養に使うのは難しい状態でした。
また、強引にトリプシンで剥離してみましたが、データシートに書かれている通り、今後はMACSビーズによる細胞Aの除去率が極端に下がってしまいました。

トリプシン以外でダメージが少なく接着細胞を剥離する何かよい方法があればお教えください。
あるいはEDTAを上手く使えば、細胞にダメージなく剥離できるものなのでしょうか？

よろしくお願いします。
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