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genomic DNA をプラスミドに入れる時のコツありますか。 トピック削除
No.12649-TOPIC - 2024/10/27 (日) 00:23:42 - shota
基礎研究4年目の初心者です。

とある人工で作成した遺伝子Aのconstructであるexon1-intron1-exon2-intron3-exon3-intron3-exon4をマウスの同じ遺伝子の位置で差し替える予定です。

その前に人工で作成した遺伝子Ａのconstructが実際にワークするかどうかを確認するため、遺伝子constructをプラスミドに入れて、まず細胞で発現を確認したいです。

その時にラボにすでにある遺伝子AのcDNAが入ったCMVプロモーターのプラスミドを使用したいと思います。そのプラスミドのcDNAの部分をexon1-intron1-exon2-intron3-exon3-intron3-exon4に差し替えることだけで遺伝子Ａのconstructがワークするかどうかを確認できますか。

genomic DNAの場合はexon1とプロモーターの間にも転写因子などがある可能性があるため、そこが懸念点です。

ご教授のほどよろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.12649-5 - 2024/10/29 (火) 01:27:28 - おお
>[Re:3] shotaさんは書きました :
> ありがとうございます。
> 発現ベクターのCMVのエンハンサー領域があるため、上流の転写因子の影響で発現低下することはあまりないということですね。
>

エンハンサーは一般的にPosition independentであるという昔からの実験結果があります。ですから下流にあっても普通はポジティブに働くと考えても良いかと（もちろん個々の例においてそうでないという事例がある可能性は否定できませんし、エンハンサー領域にTranscriptional suppressorが結合した場合抑制されるというメカニズムもあるにはありますが、それは細胞の発現するそういった因子に依存するでしょう）。

G25さんの指摘はどんな配列でも入れてみないと１００％発現することは保証できないと言うことだと思いますが、それは否定できませんがだからやめたほうがいいというふうにはならないと思います。

(無題) 削除/引用
No.12649-4 - 2024/10/28 (月) 16:36:38 - G25
>[Re:3] shotaさんは書きました :
> ありがとうございます。
> 発現ベクターのCMVのエンハンサー領域があるため、上流の転写因子の影響で発現低下することはあまりないということですね。
>

それはわからない。
インサートに内在性の転写調節配列があるかどうかにかかわらず、
インサートが異なれば発現量も変わりうるものではないか。
特に、同じ遺伝子でもコンパクトなcDNAと、長くてイントロンを含むgDNAでは、転写にかかる時間からも、スプライシングの過程を要するということもあって、cDNAのときと同等の発現量とはいかないでしょう。

ただ、CMVの強力なプロモーターで発現するので、cDNAと同等とはいかないかもしれないけど転写量はかなりあるんじゃないですか。あなたが想定している発現量に見合うかどうかはわからないですが。

(無題) 削除/引用
No.12649-3 - 2024/10/28 (月) 14:06:03 - shota
ありがとうございます。
発現ベクターのCMVのエンハンサー領域があるため、上流の転写因子の影響で発現低下することはあまりないということですね。

(無題) 削除/引用
No.12649-2 - 2024/10/27 (日) 03:33:15 - おお
>[Re:1] shotaさんは書きました :

>
> genomic DNAの場合はexon1とプロモーターの間にも転写因子などがある可能性があるため、そこが懸念点です。
>

CMVプロモーターから発現させるのに何を心配しているのかよくわからないです。発現ベクターのCMVプロモーターはCMVのエンハンサー領域を含んでます。

genomic DNA をプラスミドに入れる時のコツありますか。 削除/引用
No.12649-1 - 2024/10/27 (日) 00:23:42 - shota
基礎研究4年目の初心者です。

とある人工で作成した遺伝子Aのconstructであるexon1-intron1-exon2-intron3-exon3-intron3-exon4をマウスの同じ遺伝子の位置で差し替える予定です。

その前に人工で作成した遺伝子Ａのconstructが実際にワークするかどうかを確認するため、遺伝子constructをプラスミドに入れて、まず細胞で発現を確認したいです。

その時にラボにすでにある遺伝子AのcDNAが入ったCMVプロモーターのプラスミドを使用したいと思います。そのプラスミドのcDNAの部分をexon1-intron1-exon2-intron3-exon3-intron3-exon4に差し替えることだけで遺伝子Ａのconstructがワークするかどうかを確認できますか。

genomic DNAの場合はexon1とプロモーターの間にも転写因子などがある可能性があるため、そこが懸念点です。

ご教授のほどよろしくお願いいたします。
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