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(無題) 削除/引用 No.12647-9 - 2024/10/31 (木) 07:42:42 - 774R まあでも、空ベクターでも60-80%の細胞で変化が起きてることを見れば、統計的に判断はできますか。

(無題) 削除/引用 No.12647-8 - 2024/10/31 (木) 07:34:18 - 774R GFP positiveとはすなわちplasmidが核内移行し、mRNAに転写されたということですね。 GFP positiveが60-80%ということは、おそらくGFP negativeの細胞でもplasmidは細胞質まで入り、核内移行できなかっただけのものと思われます。それが正常ということは、核内移行と転写の過程で何かが起こってるのでしょうね。 このことを検証するために空ベクター入れても、どっちみち何も発現してこないので見分けることができず、核内移行と転写が起きてるかの判定が難しいですね。

(無題) 削除/引用 No.12647-7 - 2024/10/30 (水) 21:39:15 - TOKIO すみません。空ベクターでは試したことがありません。 ただ、GFPのtransfection効率が60-80%程度ですが、GFP negativeの細胞では正常に働いているようです。

(無題) 削除/引用 No.12647-6 - 2024/10/29 (火) 01:32:21 - おお >dsDNAの導入が問題なのでしょうか。 ちなみに、からのベクターとかでも起こりますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12647-5 - 2024/10/27 (日) 03:20:36 - おお >[Re:4] TOKIOさんは書きました : > 皆様 > > GFP陰性細胞では問題ないので、transfectionの操作ではなく、dsDNAの導入が問題なのでしょうか。 mRNA を導入するとか。まあ、GFPのタグを使わなければいいだけかもですが。

(無題) 削除/引用 No.12647-4 - 2024/10/26 (土) 21:49:10 - TOKIO 皆様 有難うございます。GFPのpossible toxicityについては承知しております。 これまでにもGFP-Xを使った実験を色々publishしてきたのですが、DNA修復関連の実験をして初めてendogensou BRCA fociや53BP1 fociの現象に気がつきました。 GFP陰性細胞では問題ないので、transfectionの操作ではなく、dsDNAの導入が問題なのでしょうか。 ただそうするとtransient transfectionの実験はDNA修復の実験系では使えない、ということになります。 これまで様々な論文で高発現系を見てきたので、使えるのではと期待していたのですが止まってしまっているところです。。

(無題) 削除/引用 No.12647-3 - 2024/10/26 (土) 16:48:47 - おお そのような特定の現象については存じ上げていませんが、GFP などの過剰発現が毒性を示す事があるという話を聞いた事があります。その時は噂レベルの話で具体性があるのかないのかと言った感じで、イースト2ハイブリッドでGFPでスクリーニングして何か釣れるとか無いかなあと漠然と思ってました。 effects of GFP expression in cellsでググると、 Fluorescent proteins such as eGFP lead to catalytic oxidative stress in cells doi.org/10.1016/j.redox.2017.03.002 GFP expression in muscle cells impairs actin-myosin interactions: implications for cell therapy doi.org/10.1038/nmeth0506-331 GFP Affects Human T Cell Activation and Cytokine Production following In Vitro Stimulation doi.org/10.1371/journal.pone.0050068 ご自身でも検索するといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12647-2 - 2024/10/26 (土) 16:21:30 - 774R GFPというより、トランスフェクションの操作自体の、あるいはdsDNAが入ることによる反応という可能性はないでしょうか？ たとえば空ベクターをトランスフェクションしたらどうでしょう？

GFPによるBRCAのdown-regulation? 削除/引用 No.12647-1 - 2024/10/26 (土) 14:10:44 - TOKIO いつもお世話になっております。 最近とあるタンパク質XのDNA修復への機能を観察しており、GFP-XをHeLa細胞に発現させるとBRCA及び53BP1の角内のfociの数が大分減少していることを見つけました。しかし、コントロールとしておいたGFP vectorコントロールでも明らかにGFP陽性細胞でBRCA及び53BP1のfociが落ちていました。 BRCA1及び53BP1は内在性の蛋白をICCで検出しております。 同じような現象は既知なのでしょうか？ご存知の方はご教授いただけますと幸いです。

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