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(無題) 削除/引用 No.12644-15 - 2024/10/26 (土) 17:36:05 - Liar >[Re:12] aaさんは書きました : > �AA1.6(13.4) B1.4(16.1)、�BA1.6(11.9) B1.3(15.2)、�CA1.5(16.5) B1.5(16.4) もう少し阻害率が高くなるように、検体を希釈してもよいと思います。 すでにほかで2倍段階希釈の提案はされていますが、2倍段階希釈をして用量依存が見られる範囲がその検体の適正な希釈倍率になるのではないでしょうか。 > 上記より、濃度が高値の場合に阻害率が低く、低値の場合に阻害率が高いように感じますが、これらは影響を及ぼす差なのでしょうか。 検体中の標的物質の濃度が低い　⇒　抗体と結合している標識抗原が多い　⇒　阻害率が高い 検体中の標的物質の濃度が高い　⇒　抗体と結合している標識抗原が少ない　⇒　阻害率が低い という関係です。 またプレート間でも、同じ濃度を示すときの阻害率は多少なりとも変動します。 ひとまず、 段階希釈で用量依存が見られるかを確認する。 検体の適切な希釈倍率を探す。 アッセイ間変動を10%未満にする（測定系の再検証）。 回収率を求める（または添加回収試験を行う）。 あたりでしょうか。 試作物を入れない賦形剤のみの検体を作製して、ウェル内で既知濃度の標準物質を添加して回収率がどの程度か確認してもよいと思います。 賦形剤の影響があるか否かは、わかるかもしれません。 健闘を祈っております。

(無題) 削除/引用 No.12644-14 - 2024/10/25 (金) 12:55:05 - おお >[Re:9] aaさんは書きました : > おおさん > > どれも真の値と言えないとのことで、打開策がありましたらご教授いただけますと幸いです。 だから測定を複数回やったなら、平均が真の値（SEMを含めて真の値があるだろう範囲）と考えればいいと申してます。 厳密に言うと統計で平均をとるというのは、真の値になるべく近い近似値を計算するということです。

(無題) 削除/引用 No.12644-13 - 2024/10/25 (金) 10:45:29 - Liar ありがとうございます。 欲を言えば15から85%の範囲にあるとよいですが、測定値として採用できそうな範囲にはあるようです。 ただ、同一濃度での阻害率が安定していないように見えます。 阻害率が50%付近の濃度が検量線の直線性が高い部分です。 この部分に検体が来るように既知濃度の標準物質を添加して、回収率を計算してみるのもよいと思います（添加回収試験）。 アッセイ内変動とアッセイ間変動についても、阻害率が50%付近の濃度で再度計算されるとよいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.12644-12 - 2024/10/25 (金) 09:48:34 - aa Liarさん 阻害率を算出してみました。 以下、吸光度から得られた濃度(阻害率)を示します。 �@A1.3(15.8) B未測定、�AA1.6(13.4) B1.4(16.1)、�BA1.6(11.9) B1.3(15.2)、�CA1.5(16.5) B1.5(16.4) 上記より、濃度が高値の場合に阻害率が低く、低値の場合に阻害率が高いように感じますが、これらは影響を及ぼす差なのでしょうか。 ご回答のほどよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.12644-11 - 2024/10/25 (金) 08:29:15 - aa あのさん なるほど、広い範囲で濃度を振って検量線とパラレルになるか確認するということですね。 検討してみます。 理論値があるため、検量線の真ん中にサンプルの理論値が来るようにサンプルを希釈してはいるのですが、、 なかなか上手くいかないものです、、

(無題) 削除/引用 No.12644-10 - 2024/10/25 (金) 08:26:08 - Liar 情報をいただきありがとうございます。 先の投稿で誤りを見つけました。失礼しました。 --- 誤：酵素抗体反応が起こらない測定系 正：抗原抗体反応が起こらない測定系 --- あのさんもご指摘のとおり、アッセイ内変動で15%は大きいです。 10%未満にするのがよろしいです。 検体を入れない標識抗原のみのウェル（濃度0のウェル）があるかと思いますが。 そのウェルが結合率0%（阻害率100%）となります。 検体のOD ÷ 濃度0のOD × 100 で阻害率が計算できます。 界面活性剤のほかは、検体中の脂質も抗原抗体反応に影響したりします。 バッファーの組成に関しては、TritonXを入れる方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.12644-9 - 2024/10/25 (金) 08:22:57 - aa おおさん 投稿ありがとうございます。 時系列順に並べたのは、測定値が徐々に増加または減少しているのではなく、試験日によって値がブレていることを示すためでした。 どれも真の値と言えないとのことで、打開策がありましたらご教授いただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12644-8 - 2024/10/25 (金) 08:06:12 - あの 2倍希釈は、極端に濃い濃度から極端に低い濃度になりそうな範囲で調整します。 論文では、そのうちの綺麗なところだけ見せます。 また綺麗になる範囲のど真ん中ぐらいをアッセイの際のサンプル量にします。 界面活性剤は、ラジオイムノアッセイの頃には、tween20 の他にも、TritonX100も一緒に入れたことあります。ターゲットは脂溶性の高そうなものでした。 成功を祈ります。

(無題) 削除/引用 No.12644-7 - 2024/10/25 (金) 07:42:16 - おお 時系列順というのが実験としてどういう意味があるのかよくわかりませんが、、、 �@�A�B�Cと４回測ったなら、平均値は真の値の近似値になるというのが統計的な考え方ですが、、、測った数値がいくらかぶれているので、どれも真の値と取れません（たまたま非常に近い値はあるかもしれませんが、だれもそれを言い当てれるものではありません）。

(無題) 削除/引用 No.12644-6 - 2024/10/25 (金) 06:25:11 - aa あのさん 投稿ありがとうございます。 理論値は、処方から判断しております。 というのも、生体試料等の測定でなく、試作物が処方通り混合でき測定値として現れるかの確認試験を行っております。 回収率、無知でお恥ずかしいですが耳にしたことがあります。 また、抗原抗体反応に影響する可能性をご指摘いただきありがとうございます。 一応、過去にも似たような処方設計で試験済みのようで、特段影響が出るような心当たりはありませんが、可能性は0ではありません。 まずはこの検証をすべきでしょうか。 検証方法としては、サンプルの2倍希釈を何点か振って置く、ということでしょうか？ ちなみに、界面活性剤は使用しており、tween20を0.1%入れております。

(無題) 削除/引用 No.12644-5 - 2024/10/25 (金) 04:46:26 - あの おっと間違い書きました。正しくは、 測定値の平均　割る　1.2 かける100 が、パーセントで表示した回収率です。

(無題) 削除/引用 No.12644-4 - 2024/10/25 (金) 04:40:48 - あの まず、その理論値は、どのように算出していますか？　自分で開発する場合には、回収率という報告すべきものになります。1.2割　測定値の平均　かける100 が、回収率のパーセントです。 もしサンプルに、抗原抗体反応に影響するものがあると、測定値に影響します。たとえば抗原抗体反応を抑制すると、競合法では、濃度が高くでます。この可能性はないですか？ この答えを得るためには、サンプルを連続2倍希釈して得たカーブと、濃度スタンダードカーブが、パラレルになっているかを見ることをおすすめします。 対策としては、濃度スタンダードにも、同様の抑制になるように、何らかの処置をするというのがあります。たとえば、サンプル混合液を希釈したものを、濃度スタンダードに入れるという方法が、ラジオイムノアッセイの時代にはありました。 ただし、ラジオイムノアッセイは液層での反応で、チューブ容量にも自由度があったけれども、マイクロプレートのでのアッセイでは、抗体が固層化されちたり、ウェル容量の制限があるため、難しい場合も多いです。 他の対策は、予算に余裕があるなら第一抗体を変える、余裕がなくてもできるバッファに界面活性剤を入れる、などがあります。 それから、初心者には、エクセルで数字を色々変えると変動係数がどう変わるか感覚を身につけることをおすすめします。変動係数は6ウェルぐらいの数字で計算すべきです。もしそれでも測定内変動が15％になるなら、ちょっと大きすぎます。10%未満にすべきです。

(無題) 削除/引用 No.12644-3 - 2024/10/24 (木) 17:51:13 - aa Liarさん 投稿ありがとうございます。 以下、ご質問に対する回答です。 ・記載した測定値は、濃度です。 ・測定系のアッセイ内変動とアッセイ間変動は、いずれも15%程度と認識しております。 ・結合率に関しては不明です。 ・泡立つ理由となる成分の量はAとBで同じです。ただ、Bは保存条件が異なるため減退している可能性もあり、その検証も含めて試験しております。 ご確認いただけますと幸いです。よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.12644-2 - 2024/10/24 (木) 17:33:18 - Liar 1.5〜1.6がその検体の値のような気がしますが... 確認ですが、この数字は濃度という認識であっているでしょうか。 それとも吸光度でしょうか。 測定系のアッセイ内変動とアッセイ間変動はそれぞれ何％でしょうか。 競合法なので、結合率が10%（または5%）以下や90%（または95%）以上の範囲にある検体は変動が大きいですが、結合率はいかがでしょうか。 泡立つ理由となる成分の量はAとBで同じでしょうか。 界面活性剤なども測定系に影響する可能性はあります。 （界面活性剤存在下で酵素抗体反応が起こらない測定系もあります） 他の先生も回答しやすくなるかと思いますので、可能な範囲で情報をいただけますと幸いです。

競合ELISA法のトラブルシューティング 削除/引用 No.12644-1 - 2024/10/24 (木) 14:52:13 - aa キットを用いず、条件検討し確立した方法で定量しています。 2回以上の試験で再現性を確認していますが、ある検体の結果が試験毎にばらつき、原因を究明したいです。 ・検体Aについて複数回試験したところ、理論値1.2に対し、測定値が時系列順で�@1.3、�A1.6、�B1.6、�C1.5とどれが真の値か判断しかねている ・同じ理論値の別ロットの検体Bを同じプレートに並べた際、�AA1.6 B1.4、�BA1.6 B1.3、�CA1.5 B1.5と、Aは上振れてBは理論値に近い、など温度管理や手技では説明がつかない差が出る ・検体は、プレートの端列を避けて配列 ・検体の調製は、粉体を秤量しメスフラスコで調整→10倍希釈→さらに2倍希釈 ・全て同じロットの抗体、発色試薬、プレート、ピペットマンを使用 ・1検体あたり16wellで試験し、その誤差は毎試験0.07〜0.1 温度管理や手技、試薬が原因でないとなると、検体調製時に何か問題があるのでしょうか。それにしても、これほどの差は出るものでしょうか。 泡立ちやすい検体のためメスアップし辛いことくらいしか思い当たりません。 皆様のご経験から何か少しでも気づきがあればご教授いただけますと幸いです。

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