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(無題) 削除/引用 No.12639-21 - 2024/10/25 (金) 14:40:21 - おお >[Re:18] G25さんは書きました : > ではなんのためにBL21(DE3)pLysSに入れたのか > just curious lonプロテアーゼ、ompT外膜プロテアーゼの欠損、T7 lysozymeの溶菌効果をりようできるので

(無題) 削除/引用 No.12639-20 - 2024/10/25 (金) 14:38:06 - G25 >T7 pol非依存的なプロモーターで発現するプラスミドを使ったときの事でしたので、その説明は当たらないと思います。 ではなんのためにBL21(DE3)pLysSに入れたのか just curious

(無題) 削除/引用 No.12639-19 - 2024/10/25 (金) 14:15:57 - G25 >これの形質転換効率を確認するためにもpETUAの空ベクターを導入した方がいい これをしておけば、宿主の形質転換能がわかるだけでなく、 空ベクターではえるなら、試薬、培地、手技などには問題がないことがわかる。 それでも当該コンストラクトでは生えてこないなら、やはり組込んだ遺伝子に固有の原因（宿主に対する毒性）があるということになる。

(無題) 削除/引用 No.12639-17 - 2024/10/25 (金) 13:08:46 - me-君 使用するコンピテントセルは市販のものです。↓ https://www.biodynamics.co.jp/wp/wp-content/uploads/2023/03/ds_ds260_j.pdf これの形質転換効率を確認するためにもpETUAの空ベクターを導入した方がいいと考えている。 NEBuilderを使って新規にベクターを構築後、JM109→IS-mutation Safeの順で形質転換、この後IS-mutation Safeからキットを使って抽出したプラスミドは完成済みのプラスミド？であるから、BL21(DE3)pLysSコンピテントセルに添加するDNA量は10 ngなどに抑える。 プレートに塗布後のコロニー培養はこれまでのように37℃で行うもの、30℃以下で行うものを用意する。 皆さんの考え的にはこんな感じでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12639-16 - 2024/10/25 (金) 12:48:16 - おお >[Re:15] G25さんは書きました : > それはDE3（T7 pol遺伝子）を持っていないか持っているかの違いだと思います。 > 非誘導時のT7 polの漏れ発現がpETに組込んだ遺伝子が発現して毒性発揮。 T7 pol非依存的なプロモーターで発現するプラスミドを使ったときの事でしたので、その説明は当たらないと思います。

(無題) 削除/引用 No.12639-15 - 2024/10/25 (金) 11:33:32 - G25 >個人的経験としてDH5アルファーでそんなに顕著な毒性がなくコロニーが拾えたのにそれをBL21(DE3)pLysSにいれると全くコロニーができないという事がありました（できているといえばできているのですが、非常に増えがわるく液体培地に移すと全くといって増えない）。 それはDE3（T7 pol遺伝子）を持っていないか持っているかの違いだと思います。 非誘導時のT7 polの漏れ発現がpETに組込んだ遺伝子が発現して毒性発揮。

(無題) 削除/引用 No.12639-14 - 2024/10/25 (金) 02:08:02 - おお コンピテントはラボで調製したものでしょうか？それともコンピテントとして調整済みの売っているものを使ってますか？ ラボで調整した場合一度コンピテンシーをラフな方法でいいですから見積もっておくべきです。出来上がったプラスミドを形質転換するなら１０＾６コロニー/ugもあれば十分ですしこれくらいならちょっと失敗してもこのくらいの効率は得られると思います。仮にこれの１０分の１の効率でも１ナノあれば１００個コロニーができるはずです。 ライゲーションプロダクトなどConstructionにつかうものなら１０＾７コロニー/ug最低ぐらいはほしいです。市販のコンストラクション用ものは１０＾８コロニー/ug以上は普通あります（最近は単に出来合いのプラスミドを増やすためのコンピテントで低効率のものも売ってますが）。 でライゲーションプロダクトなどは大抵のプロトコールは３０から５０ナノぐらいで比較的うまく行った場合１０００を超えるコロニーができても不思議ではありません。ただしインサートが入りにくいとか難しいコンストラクトもあるのでできるコロニーの数の幅はかなり差があります。私は大体電気泳動で見えるか見えないかぐらいの量をLigationで使うので５ナノから１０ナノくらいのことがたいていです。 すでに指摘があることを書いたのですが、お手元のコンピの効率などは一度確認してください。市販のものでも保存時のアクシデント（気づいているかどうかわからないことも含め）などで効率が落ちてしまうこともあります。話を聞くとBL21(DE3)pLysSにいれるのはすでに完成したプラスミドだと思うので手っ取り早いのはpETUAの空のベクターを並行してやるといいでしょう。 個人的経験としてDH5アルファーでそんなに顕著な毒性がなくコロニーが拾えたのにそれをBL21(DE3)pLysSにいれると全くコロニーができないという事がありました（できているといえばできているのですが、非常に増えがわるく液体培地に移すと全くといって増えない）。大腸菌に悪さする配列に対してそれぞれの菌株の感受性も異なる事もまあまああると思います。 ポジコンを並行してやってBL21(DE3)pLysSではコロニー形成が難しいのならBL21(DE3)pLysSではなく他の菌株を試すのがいいような気がします。IS-mutation Safeは多分K12株由来だと思いますが（たいていプラスミドを作ったり増やしたりするのはK12株）、BL21(DE3)pLysSはB株で株の相性があるとするならばK１２株由来の発現用大腸菌を使ってみるのもありかもしれません（Single-Step (KRX) Competent Cells、プロメガとかSHuffle® T7 Competent E. coli、NEBとか他にもあったかも）。またBL21由来で毒性に強いものとかたしか開発されていたと思う。 その他気になるのはプラスミドの保存状態があまり良くない（ニックとかはいってボロボロになっている）、プラスミド精製時の夾雑物の混入など。

(無題) 削除/引用 No.12639-13 - 2024/10/24 (木) 18:53:39 - G25 >研究室内では添加するDNA量を約100 ngしてもコロニーが生成している事例や1〜10 ngに希釈して添加するとコロニーが生成されない事例があります。 注意してほしいのは、それが完成済みのプラスミドなのか、ligation産物のようなクローニングの過程のDNAなのかで違うということ。リンク先は後者の話ですよね。ligaton 産物なんかだと含まれているDNAのうち形質転換能のある環状プラスミドになっているのはごく一部（か場合によっては全然ないかも）です。完成済みのプラスミドより投入量が多くなるのは当然です。 それにしたって、300 ngは多すぎですが。 別に形質転換効率や形質転換体数の高さを追い求める実験じゃないので（一個でも取れりゃいい）、プラスミド量が多すぎて困るということはありません。 cfu/ug プラスミドでみる形質転換効率は下がるだろうけど、出るものが出なくなるわけじゃない。もっとも、プラスミドが不純物を含んでいて形質転換に干渉する可能性があれば、うんと薄めたほうがいいけど。 コンピーテントセルの形質転換効率に着目したり、チェックしたことはないですか？ 普通、市販品でも自作でも10^8 cfu/ug、ものすごく悪くても10^6 cfu/ugくらいの形質転換効率はあります。 完成済みのプラスミドであれば1 ngもあれば悪くても1000 cfuを超えます。 しかし、コンピーテントセルがヘタっていれば生えてこないこともあります。 形質転換体が生えなかったとき、コンピーテントセルに十分な形質転換能があるかどうかはっきりさせとかないと対処できません。 他でも指摘されていますが、一般的なプラスミドを使ってコントロール実験を並行してやるとか予備実験をしておくとかして、使用する形質転換効率を確かめたほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12639-12 - 2024/10/24 (木) 17:36:06 - me−君 発現ベクターを変えることを先生がいい顔するかわからないので、30℃以下でプレート培養することを試してみようと思います。 さらに質問なのですが、形質転換をした際100 µLコンピテントセルにIS-mutation Safe由来のプラスミド溶液を2.5 µL加えました。その時、DNA量が約300 ng加えたことになります。しかし、次のサイトを見ると添加するDNA量は1〜10 ngを推奨しています。 https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/troubleshooting-your-transformations/#5 そして、研究室内では添加するDNA量を約100 ngしてもコロニーが生成している事例や1〜10 ngに希釈して添加するとコロニーが生成されない事例があります。 100 µLコンピテントセルに添加するDNA量について何か助言はありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12639-11 - 2024/10/24 (木) 16:44:03 - G25 そのベクターは毒性のないタンパク質用と銘打っているほどで、 毒性のないタンパク質であれば超大量に発現できるベクターのようですね。 https://www.google.com/url?sa=t&source=web&rct=j&opi=89978449&url=https://www.biodynamics.co.jp/wp/wp-content/uploads/2024/03/ds_DV200_pETUA_Jp.pdf ひとつには、pUC oriのため高コピーであること。 ふつう、発現ベクターはpBR oriでコピー数がpUC　oriの1/20以下程度です。 コピー数が多いとリーク発現や誘導発現の量が多くて毒性となることがあるから。 もう一つは、lacI^qが乗っていないこと。BL21など宿主がIcI^qを持っているのに加え、発現ベクターもlacI^qをもっているものが多いです。そのほうがしっかり蛇口が閉まってリーク発現がより強く抑制できるから。 ということで、まずはベクターを低コピー、lacI^qが乗っているスタンダードなものに変えてみることをおすすめする。 もう一つ、培養を30℃以下（25℃とか室温とか）にするのを試してみてはどうだろうか。 pUC系のoriはpBR系oriの温度感受性変異で30℃以上だとコピー数が上がるが、30℃以下だとコピー数が野生型のpBR並に低下する。コピー数を下げれば毒性を回避できるかもしれない。 とにかく、Amp培地で生えるコロニーを取らなきゃ意味ないです。

(無題) 削除/引用 No.12639-10 - 2024/10/24 (木) 14:59:31 - qq ＞プラスミドのバックボーンはpETUAです。 それはhigh-copyプラスミドですね。マニュアルにも毒性のないタンパク用と書かれています。 low-copyプラスミドの使用を検討しましょう。pETIAなどかな？ pETでhigh-copyはそれほどメリットがないような気がします。

(無題) 削除/引用 No.12639-9 - 2024/10/24 (木) 14:33:02 - me−君 プラスミドのバックボーンはpETUAです。

(無題) 削除/引用 No.12639-8 - 2024/10/24 (木) 13:12:19 - おお 泥沼に入り込む前に、ポジコンやネガコンがおけないか考えてみてください。プレートが悪い場合何があればそれが証明できるか、など。

(無題) 削除/引用 No.12639-7 - 2024/10/24 (木) 12:48:11 - G25 毒性があるかどうかは、実際にやってみないとわからないところがある。 傍証だけで大丈夫と保証はできないですよ。 >BL21(DE3)pLysSのコロニーを培養したところ、クロラムフェニコールのみを含むLB培地でしか培養できませんでした。 Ampが入っていると生えてこないということはAmpRの発現ベクター(pETのなんぼかかな）が存在しないってことでしょう。Ampは効いてるってことでないの。Ampが熱でヘタったのが原因というのは理屈に合わない

(無題) 削除/引用 No.12639-6 - 2024/10/24 (木) 12:44:39 - おお コードしている遺伝子とかの影響以外に予期せぬところでたまたまある配列が何らかの理由で大腸菌に悪さをすることがあります。発現するようにできてないベクターに人の遺伝子を組み込んだベクターですら場合によって大腸菌に悪さすることがあるぐらいですから。 ＞形質転換時に使うLBプレートを作る時、まだ暖かいタイミングでアンピシリンを加えてしまったこと アンピシリンは熱安定性がないので、熱いLBに加えたら失活します。失活したら抗生物質が効かないからセレクションできずに形質転換後プレートに撒くと一面に大腸菌が生えてきます。コロニーどころか白いものがベターと一面に増えてくると思います。暖かいタイミングと言うのがどの程度かわかりませんが、手で持ってちょっと熱いかな、でも持てるかな程度の温度であればアンピシリンはそこまで失活しません。 そのプラスミドのバックボーンはなんですか（pなんとかみたいな名前）？

(無題) 削除/引用 No.12639-5 - 2024/10/24 (木) 11:53:16 - me−君 蛍光タンパク質でVenusを使っていて、ペプチドでRevが入っています。これらを含むベクターで形質転換に成功している人が周りにいるので、毒性がある遺伝子が含まれているとは考えにくいです。 アンピシリンのみ、クロラムフェニコールのみ、その両方を含む3つのLB培地でBL21(DE3)pLysSのコロニーを培養したところ、クロラムフェニコールのみを含むLB培地でしか培養できませんでした。 今考えていることとしては形質転換時に使うLBプレートを作る時、まだ暖かいタイミングでアンピシリンを加えてしまったことだと考えています。 この他に考えられることはありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12639-4 - 2024/10/23 (水) 19:44:08 - G25 あーそれ、発現ベクターに入れた遺伝子が毒性のパターン。誘導なしのリーク発現でも宿主菌がやられる場合。 そういうの防ぐためのpLysSではあるのだけれど。 だとすると小手先じゃ解決できないかも。宿主ベクター系を変えるとかin vitro系にするとか 膜貫通領域とかその他の疎水性クラスターとかあるタンパク質だったり、 もともと細胞毒性のあるタンパク質だったりしませんか。

(無題) 削除/引用 No.12639-3 - 2024/10/23 (水) 18:23:30 - meー君 返信ありがとうございます。 NEBuilderを使って新規にベクターを構築したあとに、JM109→IS-mutation Safeの順で形質転換しており、この次にタンパク質発現用のBL21(DE3)pLysSで形質転換する段階にいます。 しかし、BL21(DE3)pLysSで形質転換しLBプレートに塗布後、16時間培養した時のコロニーが小さいです。 また、IS-mutation Safe由来のプラスミドは正しくバンドを確認できるのですが、BL21(DE3)pLysS由来のプラスミドからはpLysSのバンドしか確認できないです。

(無題) 削除/引用 No.12639-2 - 2024/10/23 (水) 17:23:12 - G25 確立済みの形質転換体の話ですか？ それとも、形質転換（プラスミド導入）をやって生えてきたプライマリのコロニーがそうだということでしょうか。その場合、完成済みで精製されたプラスミドなのか、新規に作成中のコンストラクト（ligation産物）なのか。 >培養後のコロニーが小さいこと どの段階の培養のこと言ってるのかなあと、

BL21(DE3)pLysSの形質転換 削除/引用 No.12639-1 - 2024/10/23 (水) 15:35:49 - meー君 現在、BL21(DE3)pLysSの形質転換を行っている大学4年生です。 今抱えている問題は、培養後のコロニーが小さいこと。 キットを使用したプラスミド抽出後のバンドがpLysSのみしか見えないこと。

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