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(無題) 削除/引用 No.12638-15 - 2024/10/25 (金) 14:39:44 - T4 > ちょっとメーカー名を思い出せません・・・。 おおさんの書き込みで思い出しました。Genscriptのanti-His Tag mAbがよかったものの一つです。今のフレーズは、"A Gold Standard for assay development and quality control"になってますね。でも、Hisx４でも認識するとあるので、おおさんの言うように動物細胞のlysateだと内在性Hisも拾いそうですね。

(無題) 削除/引用 No.12638-14 - 2024/10/25 (金) 05:34:25 - おお >[Re:11] T4さんは書きました : > > せっかくですので皆様からも推し共有していただければと思います。 His tagの抗体はパットしない印象が多いので殆ど使ってなく経験に基づいたおすすめはありませんが、、、コバンス（Biolegend)のモノクロは使ってました。ヒトの細胞のLysateでもそこそこ強い強制発現させていればスペシフィックに検出はできてました（ただヒトとかHisが並んだ配列のタンパク質はまあまああるので抗体が良くてもなかなか難しいことがおおいと思ってます）。 もう一つ留意しても良いいかもしれないことはC末特異的His tag抗体をつかう事かもしれません。 例えば、 GenScript His Tag (C-term) Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (25B6E11), MonoRab™ ECM Biosciences HM0501 Anti-His (C-terminal) Tag Antibody Mouse Monoclonal Abcam Rat Recombinant Monoclonal 6X His tag® antibody. C-terminal N末特異的？MHHHHHHみたいな抗体もあるのかもしれませんがちょっとわかりません。あれば同じ理屈で特異性は上がるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12638-13 - 2024/10/25 (金) 01:18:20 - ヒステリアン >T4さん ありがとうございます。BioLegend製品、余裕のある時に試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.12638-12 - 2024/10/25 (金) 00:16:06 - おお 構造的なものに加えて隣接するアミノ酸の影響もありそうですね。例えば配列非特異とされるリン酸化抗体でも周囲のアミノ酸のプレファレンスがあるという話のあるし、6xhis は通常の抗体のエピトープとしては短すぎる。Cys -HHHHHHとかでキャリアー(KLHとかでしっけ)につけて抗原として打つとかやってるだろうし｡

(無題) 削除/引用 No.12638-11 - 2024/10/24 (木) 22:35:47 - T4 > もし差し支えなければT4さんにとっての一番良い抗体を教えて下さい。 私は企業人なので言っていいものなのか、またそこには何らかのバイアスが入っていないか（調べた抗体の集め方とか）、ちょっと不安ですが、BioLegendのものを一応推しておきます。あと、世界で一番好感度と謳っていたクローンも確かにウソではないなと思ったのですが、ちょっとメーカー名を思い出せません・・・。まあ、どこもそのような文言付けていますが・・・。 私が調べたのは10年以上前なのですが、今サーチしてみると多分その後出たであろうanti-His mAbが結構ありますね。また近年ウサギモノクロがはやりですが、rabbit anti-His-Tag mAbも試したことありません。また、ポリクロanti-His Abとの比較もしていません。ご了承のほどを。 せっかくですので皆様からも推し共有していただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.12638-10 - 2024/10/24 (木) 06:16:19 - ヒステリアン 皆様、レスありがとうございます。 理屈上は有り得るけれどその可能性は薄そうだなという話を除くと、T4さんのコメに同意で、有り得そうという点では774Rさんの > エピトープの周囲の環境によってチャージが変わり反応性が落ちる可能性。 > 分子内で相互作用することで抗体反応性が落ちる可能性 だと思いました。 私が扱っているのは主に分泌型のリガンドで、その多くはN末側に存在するドメイン（Coiled-Coilドメインとか）を介して多量体を作ります。これらの多量体の状態をWestern blotで簡易的に調べる方法にReducing Agentを入れずに流すというのがあります。実際Reducing Agent抜きで流すと多量体が検出される（monomerが100kDaならDimerの200kDaのバンドも検出される）のですが、これ、実はReducing Agent有りでも多量体のバンドが完全に無くなったりしません。SDStとReducing Agentの量、加え方を色々と変えてみても（95Cで5分をもっと低温で長めにして、最終的には室温で一晩置いてみたりとか）そうです。この結果から、T4さんの >変性と言っても完璧にリニアーになりフリーに揺らいでいるわけではないでしょう に同意します。 T4さんの経験談、大変参考になりました。有難うございます。私は2種類のHis-tag抗体（R&DのMAB050と、TheromoのC末His特異的なCat.# A01857-40）を試しただけです。お話を聞いて再度ノートブックを見返してみたところ、私の場合はMAB050の方が3種類のタンパクに対する感度の違いは小さい(やはりBのintensityがA、Cに比べて低いが、20-30%減といったところ）のですが、絶対的にThermoの方が感度が高かった（Thermoの抗体ではMAB050の場合よりも一段感度の低いECLでも似たようなintensityのバンドが得られた）ので、実験にはずっとThermoの抗体を使っておりました。 もし差し支えなければT4さんにとっての一番良い抗体を教えて下さい。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.12638-9 - 2024/10/24 (木) 02:01:05 - おお >[Re:8] T4さんは書きました : > 実は私も同様の経験があります。...、みたいな単純にいいクローン・悪いクローンと分類できないものでしたし。もっもとも、その中には比較的多くに良好なクローンというのもあり、やった甲斐はありましたね。 興味深い経験談でした。 ちなみに良好であったクローンはどのクローンだったのでしょうか？ また全然だめなクローンはどれだったのでしょう（開示してもいいという判断なら）。 それとも独自に作ったということなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12638-8 - 2024/10/23 (水) 17:49:24 - T4 774Rさんの > エピトープの周囲の環境によってチャージが変わり反応性が落ちる可能性。 > 分子内で相互作用することで抗体反応性が落ちる可能性。 の考えを支持します。SDSで変性と言っても完璧にリニアーになりフリーに揺らいでいるわけではないでしょうから。 実は私も同様の経験があります。というかまさにベストなanti-His-Tag抗体を選定しようとして複数のHis-tagタンパクを複数のanti-His-Tag (monoclonal)で検出・比較しました。ある程度は予想はしていましたが、その予想以上に差があり、例えばクローンAはタンパクV, Wには感度いいけど、X, Y, Zには悪く、クローンBはV, Xにはよいけど、W, Y, Zには悪く、クローン℃はZには良いけどVには悪く、みたいな単純にいいクローン・悪いクローンと分類できないものでしたし。もっもとも、その中には比較的多くに良好なクローンというのもあり、やった甲斐はありましたね。（ついでに言うとすべてによくないダメクローンというのもありました）

(無題) 削除/引用 No.12638-7 - 2024/10/23 (水) 13:44:17 - あ 精製したならウエスタンブロットは不要だったり。

(無題) 削除/引用 No.12638-6 - 2024/10/23 (水) 13:23:57 - おお BCA assayの反応性が違って見積もりがずれているとか。

(無題) 削除/引用 No.12638-5 - 2024/10/23 (水) 11:54:29 - 774R タンパク定量はBCAでしたね。

(無題) 削除/引用 No.12638-4 - 2024/10/23 (水) 11:52:28 - 774R どのようにタンパク定量をしたのか分かりませんが、純度の問題もあるし、分解してる可能性もあるし、メンブレンをCBB染色して同程度のバンドが見えるか確認した方がいいですね。もちろんHisタグで精製した後、ゲルの染色はやってると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12638-3 - 2024/10/23 (水) 11:21:07 - おお Niビーズから溶出後にC末が削れたとか（溶出前でも削れているかもしれない、というのはNiビーズは理論上Hisが２つ続いていたら結合できるから）。 AとCはHisが並んでるところがタグ以外のところにもあるとか。 BだけTransferの効率が悪かったとか。

(無題) 削除/引用 No.12638-2 - 2024/10/23 (水) 10:54:04 - 774R エピトープの周囲の環境によってチャージが変わり反応性が落ちる可能性。 分子内で相互作用することで抗体反応性が落ちる可能性。 また、今回のタンパク質は分子量が大きいのであまり考えなくてもよいかもしれないけど、小さなタンパク質の場合、エピトープ部分でメンブレンに吸着して反応性が落ちる可能性もあります。

His抗体のC末6x Hisに対する感度は、タンパクが違うと変わる？ 削除/引用 No.12638-1 - 2024/10/23 (水) 10:40:45 - ヒステリアン His-tagに対する抗体でWestern blotを行っています。検出しているタンパクは何種類かあるのですが、全てC末に6xHisがついた形になっています。 ここで、His抗体がC'末のHisを検出する際の感度は、タンパクの種類が違っても同じでしょうか？ 検出するのはC末の6xHisの部分でも、そこ以外の部分が検出感度に影響を及ぼすことはありえるでしょうか？ 今、His-tag付きの3種類のタンパクA、B、CをそれぞれHEK293細胞に強制発現させました。A、B、Cは全て分泌型のタンパクで、培養上清に大量のタンパクが分泌されます。これらをHis-tagを使って精製し(Ni-NTA agaroseを使用）た後、BCA assayを行ってタンパク濃度も計測しました。 次にA、B、Cそれぞれ1ugをゲルに流してHis-tag抗体でWestern blotを行いました。バンドは3種類全てで綺麗に出ました（最初10ug流したら完全にoverloadだったので、流す量を減らしていきました）。 予想では、A、B、Cは全て120kDa前後の似たようなサイズなので、これで流したタンパク量も同じならバンドのintensityも似たようなものになるだろうと考えていました。実際、AとCはほぼ同じでした。が、Bは他二つの1/3から半分程度のintensityでした。なぜこうなったのかわかりません。 自分の知識では説明がつけられず、投稿させて頂く次第です。よろしくお願いします。

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