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(無題) 削除/引用 No.12636-12 - 2024/10/26 (土) 03:10:45 - おお >[Re:8] あのにますさんは書きました : > たこさん > トランスフェクション試薬はPEIを使っています。 > 培地交換していません。交換するとプラスミド取り込み量が少なくなってしまうと周りに言われたからです。交換しなくても上手くいった時期があるので要らないと思い込んでいました。 最近はいろんなTF試薬で培地交換しなくてもいいというふうに書かれているものも多いですが、毒性が気になるなら交換したほうがいいです。肌感覚としては交換しないとどんどん発現が上がるとかそんな感じはありませんし、一晩あるいは、６時間ぐらいTF試薬にさらしておけば十分な発現量が見られることが多いです。もちろん導入しにくい細胞だとなにか違いが出てくるかもしれませんけど２９３Tは簡単な方なので。 https://www.addgene.org/protocols/transfection/ こちらのプロトコールでは培地は交換しています。 こちらのプロトコールではPEIとDNAの量比をふって毒性と導入効率を見てますが、どうでしょうお手元のプラスミドの濃度測定が良くなかったり分解されていたりしたら量比がぶれて毒性が出るとかあるのだろうか。 それとDNA単独で培地に入れてみると万が一DNAにLPSとか含まれて毒性を示したりという可能性を否定できます。培養用に使えるという精製きっとならまず問題はないはずですが。

(無題) 削除/引用 No.12636-11 - 2024/10/25 (金) 20:50:09 - qq 通常培養には、anti-biotic/mycoticを入れていて、トランスフェクションのときは、抗生物質抜きではないのですか？ マイコプラズマかもしれませんが、単にバクテリアのコンタミだったりして、、？

(無題) 削除/引用 No.12636-10 - 2024/10/25 (金) 16:21:33 - PYK 細胞の状態が悪い、というのが最も可能性は高いですね。 状況は異なりますが、私も以前プラスミドの発現が急に悪くなったことがあります。 その時は、結局プラスミドの劣化（ニックが入っている？）が原因で、大腸菌にトランスフォームし直して精製したものを用いたらうまくいくようになりました。 濃度が濃くても、TEの保存していても、特に4度保存ですと、プラスミドは劣化しやすいような気がします。

(無題) 削除/引用 No.12636-9 - 2024/10/25 (金) 00:18:11 - たこ あ、PEIですか。 PEIではやったことないのでmedium changeがessentialかどうかわからないですすみません。 てっきりLipofectamineの類だとばかり・・・

(無題) 削除/引用 No.12636-8 - 2024/10/23 (水) 12:09:42 - あのにます たこさん トランスフェクション試薬はPEIを使っています。 培地交換していません。交換するとプラスミド取り込み量が少なくなってしまうと周りに言われたからです。交換しなくても上手くいった時期があるので要らないと思い込んでいました。今度試してみます。 接着生存成長には影響しないはずのものです。 ありがとうございます。 おおさん マイコの感染とdnaの状態は確認してみます。 トランスフェクション時の培地はいまopti-memを使っているのでグロースメディアでもやってみます。 ポピュレーションについて、そういえば細胞が均一に撒けなかったとき、細胞が偏っている部分だけ全然剥がれず、細胞数がスカスカだった部分はボロボロに剥がれていました。偏っている部分は取り込まなかったから剥がれなかったのだと思っていましたがよくわかりません。均一に撒けているときは全部剥がれます。細胞数と回収時間も検討する必要がありそうです。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12636-6 - 2024/10/23 (水) 07:01:50 - おお ま、騙されたと思って一度マイコを簡便なアッセイでみてください。メタノールとかPFAで固定してDAPIとかHoechstで染めれば低感度ですが、見れないことはないです（見れないレベルの感染の可能性は否定できませんけど）。 もしトランスフェクションのとき血清を含まない培地で培養しているならTF試薬の毒性が幾分強くでることもあります。なのでTF試薬の量を減らす（DNAとの量比は保ったまま）のがそういうときに第一に考えるところかと思います。また、293Tなら普通のグロースメディアにDNAと試薬のコンプレックスを加えても十分発現します（十分というのは科学的ではないですが）。 細胞のポピュレーションによっても毒性ので方が変わってきます。おおいほうが見かけ耐性があるように思います。 DNAは細胞培養用に精製できるキットを使っていれば精製度に関して問題が起こるとは思えませんが。念の為そのまま電気泳動してみてインタクトかどうか確認してみてもいいかもしれません（壊れているから毒性が出るということはないとは思いますが）。

(無題) 削除/引用 No.12636-5 - 2024/10/23 (水) 00:31:09 - たこ Lipofectamineとかなんでしょうけど、293Tなら最適のconfluencyで突っ込めば発現する印象。 ほんで4−６時間後の培地交換をやってればまず剥がれることは経験上ない(どのLipo試薬かに依存する部分もあることはあるが)。 勢いよく培地突っ込んで物理的に剥がす輩はいましたが。 可能性としてはおおさんのおっしゃるようにマイコの可能性を１つ疑います。 あと念の為ですが、細胞接着に影響する、あるいはgrowth, survivalに多分に影響するような遺伝子を発現させてるわけじゃないですよね？

(無題) 削除/引用 No.12636-4 - 2024/10/22 (火) 16:00:25 - あのにます おおさん プラスミドはmidiprepキットを使っていて、最後イソプロ沈殿したのち10 mM tris pH8.5に溶解したものです。ずっと同じ溶液を使っています。 細胞を均一に撒くのが苦手で、撒いてからしばらくインキュベーターにいれずベンチに置いたままにしたりしたことがありました。思えば状態に気を使っていなかったかもしれません。ありがとうございます。 あさん ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12636-3 - 2024/10/22 (火) 15:35:26 - あ 同じことをやっているのに同じにならないのは、何かが違う状態になっているからですけど、以前と何が違うのかは本人にしかわからない。すまん

(無題) 削除/引用 No.12636-2 - 2024/10/22 (火) 14:06:10 - おお 細胞がマイコプラズマに感染しているとか？元々感染していた細胞で、突然悪さし始めるってこともある｡ プラスミドは全て同じもので同じロットですか？精製方法は？ 細胞は良い生理状態を保ててますか？毎回状態が違えば結果も違う可能性がありますから｡

293Tへのtransfectionの実験がうまくいかない 削除/引用 No.12636-1 - 2024/10/22 (火) 13:51:39 - あのにます 293tにプラスミドをトランスフェクションして発現を見ようとしています。 始めはなんの問題もなく、3週間ほど同じ実験を繰り返していましたが、ある時、トランスフェクションすると細胞が殆ど剥がれていました。その後何度か細胞を起こし直したり、培地やトランスフェクション試薬を新しくしても同じ結果でした。続けて実験していると、全然剥がれず正常に増殖している日がありました。これを回収してWBすると、かなり発現が悪かったです。こういった経験のある方はいますか？一番聞きたいのは、細胞が剥がれるようになった理由です。プラスミド溶液が何かに汚染されたのでしょうか。

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