Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

ウエスタンブロットのバンドの位置 トピック削除
No.12632-TOPIC - 2024/10/21 (月) 12:07:00 - 某大学院生
　主に核に発現するある転写因子のウエスタンブロットをしているのですが、細胞株からwhole cell lysateを抽出した場合と、核タンパクを抽出した場合とで出現するバンドの位置が10kDa以上違って見えるのですが、そのようなことは一般にありますか？
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.12632-5 - 2024/10/21 (月) 18:24:59 - G25
whole cell lysateと核画分どちらが大きいのでしょう。

糖鎖修飾や脂質修飾（核タンパクならないか）、リン酸化、などによる修飾で分子量が上にシフトすることはあると思いますが。

あとはもともとcleavageよるプロセッシングがあるとか。例えば核にはcleavageされたフォームだけが入るとか。

ただ、だとすればwhole lysateで両方が見えても良さそうだけど。
核にあるフォームは濃度が低くて核画分として濃縮しないと見えないだけかもしれないけど。
あとは単純に、精製過程で内在性のプロテアーゼによってcleavageされたartifactとか。
で、最初の質問、

(無題) 削除/引用
No.12632-4 - 2024/10/21 (月) 16:02:26 - 独り言
修飾によって核内と、細胞質のタンパク質の分子量が異なる場合は、十分に考えられます。

もしくは、核分画は、whole cell lysateのなかにも含まれているはずなのに異なるのであれば、
もしかして、それぞれの泳動したサンプルの塩濃度や界面活性剤などが全くことなったりしませんか？
ウェルにアプライするサンプルのバッファー組成によって移動度が影響を受けることもありうります。

なので、細胞質分画と、核分画を単離して、それぞれ最終的に同じバッファー組成になるように調整して、泳動しても分子量が異なるのなら、修飾の可能性がより高いかと。

(無題) 削除/引用
No.12632-3 - 2024/10/21 (月) 16:01:13 - おお
あっても不思議では無いですが、実験的に、あるいは今まで発表されているデータなどから特異的なバンドである事示すべきだと思います。そう言う事例がいくらあっても、あなたのタンパクでなければ同様のことが起こっている保証がありませんから。

で考えられる事としてはいくらかあって、リン酸化の違いはすでに指摘がありますがそのほかSUMO 化が核移行を促し核ではSUMOがついていると言うタンパクもあるし、転写因子のO-GlcNAcylationが核移行を促進し転写因子としての活性を増強すると言う話もある｡これらはリン酸化よりサイズの変化が顕著な事が多い。

またサイズが減るパターンとして、サイトゾルで切断されて核移行するものもある。

アセチル化やメチル化でもサイズが変わることもあるだろうし、核との関係は知りませんがPeptidyl Prolyl Isomeraseの作用をSDSPAGEのサイズで確認できることもあるようです。

(無題) 削除/引用
No.12632-2 - 2024/10/21 (月) 12:45:00 - TS
リン酸化などの翻訳後修飾なら10kDa以上ずれてもおかしくないと思います

例えば、その転写因子はリン酸化などの翻訳後修飾を受けて、核に移行するということはないですか。核抽出物を使うと、修飾後のものを検出していて、Whole cell extractの場合、細胞質の修飾前のものが主に検出されているとか。核画分をとっておられるなら、細胞質画分（あるいは核を除いたもの）が取れると思いますが、そちらをWBしたらどうなるでしょうか。

あるいは上記のような量的な問題で、実は全く別のタンパク質を検出（観察）しているとか。

ウエスタンブロットのバンドの位置 削除/引用
No.12632-1 - 2024/10/21 (月) 12:07:00 - 某大学院生
　主に核に発現するある転写因子のウエスタンブロットをしているのですが、細胞株からwhole cell lysateを抽出した場合と、核タンパクを抽出した場合とで出現するバンドの位置が10kDa以上違って見えるのですが、そのようなことは一般にありますか？
全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。