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解決しました。 削除/引用 No.12629-10 - 2024/11/01 (金) 12:54:37 - かけだし 皆様ありがとうございました。 PCRがうまく動いていなかったのが原因だったようで PCR反応の際、f.c. 5% DMSOを加えて実施すると上手くかかりました。 その後、インバースPCRで構築完了しました。 ご指導のほどありがとうございました。 今後も勉強させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.12629-9 - 2024/10/21 (月) 10:40:43 - かけだし G25様 コメントありがとうございます。 私もPCRがそもそも上手くいっていないような気がしてきました。キット付属のposiはワークしているのでプラスミドとの相性でしょうか。 皆様のアドバイス通り他の方法を検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.12629-8 - 2024/10/21 (月) 10:39:36 - かけだし 774R様 コメントありがとうございます。 変異導入を行うのが初めてなもので、ひとつのやり方に固執してしまっていました。 ラボでの第一選択が表記キットで周りがほぼそちらを使用している(他の方法をやっているのを見たことがない)のもあって、発想がなかったのもあります。 反省です。 アドバイスありがとうございます。 Inverseも検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.12629-6 - 2024/10/21 (月) 10:34:06 - かけだし おお様 コメントありがとうございます。 ＞新たに生じたStopコドンの下流を除く理由は何かなとも思います。たとえば生体内ではStopコドンができたてもその下流の配列は存在してますよね。どのような実験を考えているのかで方法論も変わるでしょうからおかしいとまで言いませんけど。 このPlasmidは Ｎ-[ 目的ORF (終止コドンなし)＞[eGFP＞-C　とダイレクトに繋がっています。eGFPで変異体の局在をみたいので終了コドンが途中にあると困ってしまうのです。プロモーターはそれぞれ独立させていません。 他の方も言及されておりましたが、PCR後アガロースゲルで泳動してもバンドはほとんど見えません。しかし、他の変異体作製時でもみえないほど少なかったですが作製できたので、おかしいなとも思いつつ続行していた次第です。

(無題) 削除/引用 No.12629-5 - 2024/10/20 (日) 16:26:54 - G25 > 普通に1塩基欠損変異を含むプライマーと、それ以降の削りたい部分の後ろから始まるプライマーセットでinverse PCRすればよくないですか？ 私もそう考えました。 お使いのキットのようにPCRだけでligation independent に環状化するなんて洒落たことしないでも、 上記のようなPCR産物をLigaseで環状化する方法は？ 泥臭いようでも、原理的にもプライマー設計もless trickyじゃないでしょうか。 https://lifescience.toyobo.co.jp/detail/detail.php?product_detail_id=1 それだけドツボにハマってしまったら、今の実験デザインや手法に固執しない方がいいんじゃないか。

(無題) 削除/引用 No.12629-4 - 2024/10/20 (日) 15:01:59 - 774R 普通に1塩基欠損変異を含むプライマーと、それ以降の削りたい部分の後ろから始まるプライマーセットでinverse PCRすればよくないですか？ 余計な制限酵素サイトを加えたりしたくないのであればIn-Fusionを使ってinverse PCRのプライマーセットに15bpのオーバーラップを付加すればよい。

(無題) 削除/引用 No.12629-3 - 2024/10/20 (日) 11:34:07 - G25 > Mutagenesis後、PCR産物を精製し、ORFだけ制限酵素で切り出して空ベクターに入れようと試みるもPCR産物精製時点でほぼ産物なし。 精製前のPCR産物はちゃんと存在を電気泳動で確認しているのでしょうか。 精製と言うのはゲル切り出し、それともカラム精製のみ？ ちゃんとあった産物が精製後に無くなったなら、精製過程の問題で系がうまくいかないのとは 問題が別かなと思います。 そもそもPCRが上手くかかっていないんじゃないかと言うのが第一印象です。 それと、実験デザインがずいぶん回りくどいように思えますが (一塩基欠失でフレームシフトを起こしてpremature terminarion codonを生じさせる->3’ UTRを欠失させる) そうする理由があるのでしょうか。 使用しているキットと同じあるいは類似の系で、終止コドン導入と3’ UTRを欠失を同時にできそうに思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12629-2 - 2024/10/18 (金) 01:08:42 - おお 変異導入のやり方は絶対的なものはなく、柔軟に考えるといくらでも代替え方法があります。 例えばミューテーションが入ったベクターへ向いているプライマーで変異の位置から下流を含むようにつくる（生じるストップコドンまで伸ばせれば理想的）。 上記のプライマーとオーバーラップしないように反対のプライマーをつくる。５’側は上記のプライマーでストップコドンまで達してないなら、そのストップコドンまでの下流とベクターの配列までのジャンクションの配列を含めておく。 これでInverse PCRをして末端をリン酸化して（あるいはリン酸化したプライマーを注文して）Ligationする。 その他にも近辺で制限酵素で切れそうなところがあれば、その部分を入れ替えれる変異導入フラグメントをつくるとか、いまはIn-fusionやNEB builderのようなものもあるので、制限酵素がなくても対応できるし。 ＞Mutagenesis後、PCR産物を精製し、ORFだけ制限酵素で切り出して空ベクターに入れようと試みるもPCR産物精製時点でほぼ産物なし。 PCRが怪しいですね。PCRがワークしてないと思われる。 こういうのは絶対に理論通りいくかというとそうとは限らないので私はなるべくプランBを並行して用意するか、頭の片隅に入れておくようにしてます。 ところで一塩基欠失のところでつまずいていて、その後にDeletionしようとしているのでしょうか？それとも欠失と下流のDeletionを同時にできるようにデザインしているのでしょうか。 新たに生じたStopコドンの下流を除く理由は何かなとも思います。たとえば生体内ではStopコドンができたてもその下流の配列は存在してますよね。どのような実験を考えているのかで方法論も変わるでしょうからおかしいとまで言いませんけど。

plasmidのORF部位にSNPを入れたい 削除/引用 No.12629-1 - 2024/10/17 (木) 19:32:14 - かけだし いつも勉強させていただいております。 あるplasmidのORF部位に一塩基欠失を入れたいのですが苦戦しています。 お力を貸していただけたらと思いスレ立ていたしました。 詳細を下記に示します。 Plasmid：約8kb, ORF 3kb程度 mutation: (1) 開始コドンより 1kb程度のところで一塩基欠失を加えてフレームシフトを起こし、その結果変異導入した部位より下流で終止コドンが発生する。 (2)この一塩基欠失誘導Plasmidを鋳型とし、終止コドン以降から最適なところまで再度Delitionを誘導して変異型Plasmidとしたい。 使用Kit：PrimeSTAR® Mutagenesis Basal Kit/TaKaRa サイトで説明されているオーバーラップシステムを使って何度か試みていますが(1)の段階でつまづいています。 ・1〜2回目 　大腸菌にトランスフォーメーションしても増えが悪く、無理矢理増やしてMiniprep後、シーケンス解析をしても読めない。 ・3〜4回目 　Mutagenesis後、PCR産物を精製し、ORFだけ制限酵素で切り出して空ベクターに入れようと試みるもPCR産物精製時点でほぼ産物なし。 以上です。 他の種類の変異はTaKaRaが出しているプロトコール通りで問題なく作製できたので、試薬・手技の問題ではないかと考えています。 抜けている情報もあるかもしれませんが、ご助言・ご指導いただけるととても助かります。何卒よろしくお願い申し上げます。

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