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(無題) 削除/引用 No.12625-10 - 2024/10/18 (金) 01:20:34 - おお UV（A260）ではたしかに厳しいような気がする。ISOGENのような試薬はフェノールやグアニジンが入っていてその持ち込みが悪さする可能性があるので少なくとも精製後にもう一度エタ沈したりしている。蛋白もまあまあ含まれていたりもするのでエタ沈するならクロロフォルム後にすることが多い（フェノールが抜ける）。微量でそこまでやるとどうなるかというのはあるけど。少なくともイソプロパノールで沈殿したあと、７０％エタノール洗浄を２回やるなどそのへんは慎重にやればベターだと思う。微量だと次のステップに持ち込む夾雑物も多くなるので。 でもやはりあなたのターゲットのプライマーがその微量な状況でPCRがかかるものなのかなどは確認しておくべきのような気がする。

(無題) 削除/引用 No.12625-9 - 2024/10/17 (木) 18:00:56 - G25 そんなに微量なら吸光度による計測はあてにならないと思う。 ノイズに埋もれて何を測定しているのやら。 蛍光色素法(QubitやQuantas）やBioanalyzerがほしいところ RT-PCRは逆転写系、PCR系の性能が大きく影響する。 どれをお使いでしょう。 それとreal-time PCRなのかend-point PCRなのか

(無題) 削除/引用 No.12625-8 - 2024/10/17 (木) 17:26:24 - ダメダメ大学院生 教えて頂きありがとうございます。 Internal controlのACTBは増幅できています。 Primerは確実に増幅されるsampleでcheckしてあり問題ないと思っています。 Sampleを大量に採取できれば良いのですが、マウス1匹から1本しか採れないのです… 吸着Gradeは確認してみます。 一応、エタ沈を使用しています。 RNA/DNA抽出液で回転撹拌を30minやってみましたが、目に見えて大きな改善はなさそうです。 実体顕微鏡下で採取しているので、そのまま細断tryしてみようかと思います。 Total RNAは抽出できています(と思います)。 分光光度計での評価ですがDNAと同程度の濃度、A260となっています。 同程度の時点でダメなんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12625-7 - 2024/10/17 (木) 01:35:38 - おお ああ、確かにキャリアーは使ったほうがいいですね。昔はグリコーゲンとか使われてましたけど今は使わないのかしら。物によっては着色していてペレットが可視化できるっていうものもあったような。

(無題) 削除/引用 No.12625-6 - 2024/10/16 (水) 21:52:40 - SN Total RNAが取れていないのか、標的のmRNAのみPCRでうまくいかないのかで対応は違うと思います。 RNAの品質、プライマーは問題ないですか？そうでなければ、うまくピックアップできていないのが原因ではないですかね。目的の微小構造とその周辺組織でmRNA発現量が全く異なる可能性もあるかなと。確実にターゲットの細胞が含まれるように組織をとったら検出はできますか？

(無題) 削除/引用 No.12625-5 - 2024/10/16 (水) 17:14:56 - G25 微量であるほど吸着ロスやフェノール抽出の分配によるロス（フェノール相や中間相の取り分）のインパクトが大きくなります。 低吸着の器具を使うというのももちろんですが、古来、その手のロスを防ぐためにcarrierを入れるという手法が良く使われていました。 RNAと物性の似た物質を過剰量に入れて抽出RNAにかかるインパクトを下げてやるのですね。 昔は過剰量のyeast tRNAなんかを投入したりしましたが、PCRベースの実験がデフォルトになっているような昨今、生物由来のcarrierはノイズになる可能性があるので不適当でしょう。 市販の合成品のpoly Cなんかをつかっている文献を昔みた記憶がある。linear polyacrylamideなんかも使えそうな気がする。

(無題) 削除/引用 No.12625-4 - 2024/10/16 (水) 05:34:08 - あの 文字化けはした箇所は、20から30分です

(無題) 削除/引用 No.12625-3 - 2024/10/16 (水) 05:32:58 - あの 当方では同様な実験をしたことはありませんが、微少量の材料の場合には、次の２点を確認してください。 　マイクロチューブやチップは、低吸着グレード(low binding grade)を使っていますか？ 　アルコール沈殿する際には、エタ沈メイトのような、共沈するものを使っていますか？ これらに問題がないならば、RNA抽出液での処理時間を長くしてみます。20〜30分とか。撹拌もして。 それでもダメなら単なる案ですが、実体顕微鏡の視野の中で、材料にメス刃で傷を入れながら、抽出液処理することも考えます。 つまり、化学的消化を長くするか、物理的消化を確実にする、です。

(無題) 削除/引用 No.12625-2 - 2024/10/16 (水) 05:16:25 - おお 目的のmRNAとありますが、Internal controlなどは増えてますでしょうか？ 例えばそれなりのRNA量取れる組織や細胞でRNAをとってRTPCRのインプットをお示しの試料から取れるRNA量くらいまで下げて目的のRNAは増幅されますか？ 同様のサンプルを１０個とかまとめてからRNA精製できますでしょうか？ 組織の破砕の状況とかも気になりますが、、、そばで見てないとわからない。 ダメ元というなんともアドバイスになってないのですがこちらの試薬とかどうでしょう。 https://www.mrcgene.com/product/rnazol-rt シグマも扱ってます。 ＞微量検体からのゲノム抽出について、経験がありましたら ゲノムは取れているのですよね、、、

特殊な微量検体からのRNA/DNA抽出 削除/引用 No.12625-1 - 2024/10/16 (水) 00:24:53 - ダメダメ院生Re いつも勉強させて頂いております。 当方、特殊な微量検体からのRNA/DNA抽出に四苦八苦しており、皆様のご意見を頂きたくトピックを作成させて頂きました。 ・直径50μmで長さ3mm程度の管腔構造 ・内腔表面にtargetの細胞が位置 ・外周は結合組織で覆われている 上記、小腺管のようなsampleを摘出し、ISOGEN�UおよびISOGENOMを使用してRNA/DNA抽出を行っています。目的のDNAはPCR upできるようになったのですが、目的のmRNA(cDNA)のPCR upに難渋しております。 このような特殊な微量検体からのゲノム抽出について、経験がありましたら体験談、注意点、コツなど教えて頂けると嬉しいです。 何卒、よろしくお願いいたします。

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