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(無題) 削除/引用 No.12606-9 - 2024/10/05 (土) 00:29:06 - おお 配列が読みにくいところがあって変異が入っているように見えるとか言うのは、、、ないかな。。。Nが出てくるのでそれはわかるか。。。 ちなみに波形データーは見てますよね。。。 裏から読んでも一致するだろうか。

(無題) 削除/引用 No.12606-8 - 2024/10/04 (金) 23:32:24 - mutator >[Re:7] あさんは書きました : > PCRで増幅した断片（大腸菌に入れる前）には、その余計な変異は入っているのですか？ 変異は複数箇所にランダムに入るようですので、ご質問に回答するのは容易ではないと思われます。

(無題) 削除/引用 No.12606-7 - 2024/10/04 (金) 12:07:28 - あ PCRで増幅した断片（大腸菌に入れる前）には、その余計な変異は入っているのですか？

(無題) 削除/引用 No.12606-6 - 2024/10/04 (金) 08:25:03 - 774R なんとなくですが、オリジナルの配列のDNA自体ががtoxicだと仮定して考えてみると、わずか1塩基や2塩基の違いで毒性がなくなるのは考えにくい。 leakyに発現するタンパク質の毒性が大腸菌の生育を阻害しており、機能を失わせるnon-synonimous変異が入った時だけ生育すると考えたら合点がいく気がします。

(無題) 削除/引用 No.12606-5 - 2024/10/04 (金) 07:51:30 - mutator 選択が働いて変異を持ったまれなクローンのみが残ってくるのであれば、いつもより効率（形質転換体の数）がかなり低くなるはずですが、そのようなことが観察されていますか？ また、シークエンスできちんと配列が確認できるのであれば、形質転換が成立したとき（もしくはその直後）以降は新たな変異が入り続けるような状況ではない、つまり野生型は不安定だが変異型は安定ということになります。これは、取れてきた変異入りのクローンに対して同じ操作をしたら、新たな変異が入るようなことは起こらないかどうかで確認できますよね。そんなことまでやる気がしないとは思いますが。 経験の浅い学生が同じことを言ってきたなら、鋳型に使った親プラスミドストックが多数の変異体を含んだヘテロなものなんじゃないかと疑って、親プラスミドを再形質転換して正しい配列を持ったクローンであることを確実にしてから再挑戦しては、と助言すると思います。

(無題) 削除/引用 No.12606-4 - 2024/10/04 (金) 07:21:00 - TK-1 bacteria strainを変える。

(無題) 削除/引用 No.12606-3 - 2024/10/04 (金) 04:36:29 - おお たいてい困る場合は、おそらく入れたDNAの配列が何らかのメカニズムで大腸菌に影響をあたえクローンが生えにくくなって入っているフラグメントもなんだかわからない事がよく起こるのですが変異が入って結構なクローンが生えてくるのですね。 手探りでできることはコンピテントの株を変えてみたりすることと思います。まあ理屈はともかく変更したら良くなったというケースはまあまああります。理屈を考えて変えるのならPCRフラグメントにつよい株、プラスミドの毒性を考慮して低コピーナンバーを維持できる株などあるにはあります（通常の大腸菌でも温度を下げることで制御ができます）。 あとテンプレートをサイドシングルクローンからあまりスケールアップしないで（ミニプレップで）精製してみてください。そういう不安定なプラスミドだと増やしているときに微量ながら変異が入っていて、変異が入ったものが複製などに有利なためそう言うばかりが増えてくるということもあるかもしれません。 またInverse PCRでなく局所だけをPCRしてベクターに入れ込むのもやってみていいかもしれません。 悩ましい問題ですね。。。

(無題) 削除/引用 No.12606-2 - 2024/10/03 (木) 17:07:50 - あ サクッとDNA合成しちゃった方が良くないですか。

ある特定の遺伝子のクローニングだけ変異が入りまくる 削除/引用 No.12606-1 - 2024/10/03 (木) 16:54:59 - PCR お世話になります。 私はヒトやマウスを対象とした分子生物学、細胞生物学のバックグラウンドを持つシニア教員です。 これまで数多くの遺伝子クローニングを行い、プラスミド作製を行ってきましたが、今私が研究しているせいぜい2.2 kbほどのサイズの遺伝子については、そのクローニングに躓くことを繰り返しています。 具体的にはwild-typeの発現プラスミドをもとに、一アミノ酸変異を導入するため、inverse PCRを行っています。Dpn1消化、ゲル抽、リン酸化、ライゲーション、形質転換と行い、配列を確認すると期待するアミノ酸変異に加え、２つほどの変異（non-synonimous）が見つかります。 KOD-OneやPrime Star MAXを使って、15サイクル程度にしかPCRは回していません。 これまで8 kbにも及ぶ遺伝子クローニングに関しても問題なく行えており、15サイクルで変異が入るとは信じ難いと感じています。 PCR鋳型はwild-typeの精製したmidi-prepプラスミドです。 実はこの遺伝子の別の変異導入は２年前にも行ったことがあり、その時にも同様に予期せぬ変異が入り目的のものを取るために数多くのコロニーをシークエンスしました。それぞれのコロニーで全く異なるミスセンス変異が入っていましたのでwild-typeのplasmidに元から入っていた変異ではないです。 他の遺伝子に関しては25サイクルと回そうがここまで変異が入ることはないので、この遺伝子特異的な現象では、、と思わずにいられません。 このようなことはどう説明ができるでしょうか。 何か改善策がありましたら、どうかご教示いただけませんでしょうか。 何卒よろしくお願いいたします（現在、この遺伝子に関してはmutagenesisを行うことに不信感があります）。

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