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(無題) 削除/引用 No.1260-6 - 2012/12/19 (水) 09:51:06 - ~ タイミングが少し違いますが、1回リポフェクションして、セレクションして発現クローンを得て、 再度その株に別の薬剤耐性ベクターでリポフェクションして、より高発現の株をとったことはあります。 そのため、2回のリポフェクションでそれぞれベクターは細胞内に入り、それぞれからの発現があるでしょう。 LTXとどちらのコストがかかるかわかりませんが、免疫沈降で濃縮して検出することはできませんかね。

誘導発現ができる細胞は？ 削除/引用 No.1260-5 - 2012/12/18 (火) 10:22:53 - mon 一過性遺伝子導入は、細胞毒性のコントロールが難しいのが難点ですね。特に神経由来細胞の場合、生存率が毎回異なるので、比較実験が難しいのが欠点です。一過性遺伝子導入によりいろいろなシグナルが細胞内に入ることも結果の不安定性をもたらします。 また、 > さて、私が現在行っている因子はプロテアソーム処理を受けているため とのことですが、「過剰発現させるとmisfolding proteinが増えプロテアソーム処理を受ける」ということではありませんか？ この場合闇雲に過剰発現させても生理的条件を反映していない可能性が高くなりますが問題ないでしょうか。 私は同様な性質をもつ「あるタンパク質」の性質を調べる実験で、一過性発現を諦め、安定発現細胞の樹立を試みましたが成功せず、最終的に(変異型も含め）誘導発現ができる細胞をレンチウィルスベクターで作製しました。その結果、一過性発現(既報）、 安定発現細胞(既報）とは異なる結果が得られ、これまでの個体での観測結果とも矛盾しないような結果でした（投稿準備中）。 ですので、急がば回れで誘導発現ができる細胞の樹立をお薦めします。

(無題) 削除/引用 No.1260-4 - 2012/12/17 (月) 23:57:53 - おお 293などを使う限りに置いては、 T-antigen-SV40oriの系を使う方が有利かと思います。293TやCOS7などは T-antigenがはいっていますのでお使いのプラスミドにSV40oriがのってるか確認されてはどうでしょうか。 神経細胞はレンチでCAGプロモーターを使った物を使えばましになりそうですが。 これも既出のアイデアですが、その遺伝子産物のユビキチン化にかかわる遺伝子をどうじにKDするとか(直接じゃなく、ユビキチン化されて壊れるpathwayが使われていればですが)。

(無題) 削除/引用 No.1260-3 - 2012/12/17 (月) 21:55:08 - コスト ダブルのsiRNAトランスフェクションは有効です。 あなたのその場合、293Tであればそれで改善すると予想します。２回目で80％コンフルエント以下なら再播種する必要もありません。メーカに聞いてもらえば分かりますが、DNAが入るのは最初の数時間のみ（のよう）です。 ＞しかし、本当に入れたいのはマウス神経培養細胞 細胞種が違えば、とんでもなく効率が落ちるのが普通です。だめでもともと、必ず、293Tなどのコントロールを取るとよいです。１サンプルにつき24ウエルで２ウェルしか私は使いませんが、その場合、コストはかなり低く抑えられると思います。

(無題) 削除/引用 No.1260-2 - 2012/12/17 (月) 21:30:06 - KY 過剰発現が必要とのことですが、2回トランスフェクションが理想的にうまくいったとしても、その神経細胞に一回トランスフェクションした時よりも2倍以上の発現になることはないと思います。元々検出限界なのであれば、2倍でも結局ほとんどの細胞で発現がしてない状態だと思います。 それよりもユビキチン化されない変異体を作成した方が、分子生物学的に納得できる実験になると思います。

導入効率UPのため、2日連続トランスフェクションするアイディア 削除/引用 No.1260-1 - 2012/12/17 (月) 18:43:18 - 入らない いつも勉強させていただいております。 さて、私が現在行っている因子はプロテアソーム処理を受けているため過剰発現させてもWestern blotで検出が難しいです。 いろいろ試した結果、High copyかつhigh transfection効率でないと検出不可能なようで、HEK２９３でLipofetamine LTX(Pluse Reagentあり）によるトランスフェクションでようやくMG132なしでも検出可能ということがわかりました。しかし、本当に入れたいのはマウス神経培養細胞であり、LTXを用いてもMG132なしで検出は不可能です。さらに、MG132は実験の都合上使用不可能です。 そのような時、RNAiの場合ではトランスフェクションした翌日、播種しなおして再度トランスフェクションするとKnock Down効率が格段に上がると聞きました。 そこで、過剰発現の系でも試してみようかと思っていますが、LTXが高価なので試すか悩んでいます。 ゆえに、皆様の中で試したことがある方おられましたらご経験をお聞かせいただきたく思い投稿させていただきました。 経験ない方でも、試す価値があるかないか、アドバイスいただければと思っております。 また、別のアイディアとしてはネッパジーンによるエレクトロぽレーションの後、翌日LTXでトランスフェクションするということも考えております。そちらも合わせてご意見いただければ嬉しく思います。

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